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Meccanismi di uccisione dei linfociti T citotossici

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I linfociti T citotossici (CTL) sono cellule effettrici antigene-specifiche del sistema immunitario con la capacità di lisare cellule bersaglio come cellule infette da virus, cellule allografate o persino parassiti in modo dipendente dal contatto. Come altri linfociti T, CTL inizialmente si differenziano nel timo, dove acquisiscono il recettore specifico delle cellule T (TCR), un eterodimero 90-kDa composto da una catena α di 40-50 kDa e una catena β di 37-45 kDa ., Il TCR è strettamente associato alla glicoproteina CD3, un complesso di tre-cinque proteine invarianti che sono apparentemente responsabili della trasduzione del segnale. La maggior parte di CTL inoltre sopporta le molecole CD8, pensato per legare reversibilmente al ricevitore delle cellule bersaglio. Altre molecole di superficie (CD2, CD28, molecola di adesione intracellulare) sembrano svolgere un ruolo importante nell’attivazione del CTL dopo il riconoscimento dell’antigene tramite TCR.

CTL sono incapaci di riconoscere antigeni liberi., Gli antigeni sono quindi inizialmente assorbiti da cellule specifiche come le cellule dendritiche e le cellule di Langerhans, che elaborano e presentano l’antigene sulla loro superficie insieme a molecole del complesso di istocompatibilità maggiore di classe I (MHC I). Pertanto il legame antigenico del CTL è sempre limitato ai determinanti MHC corretti. Il riconoscimento e il legame dell’antigene sono seguiti dalla proliferazione e dalla differenziazione del CTL, un evento promosso da varie citochine . L’attivazione antigene-specifica di CTL è associata ad alterazioni morfologiche distinte., Le cellule aumentano di dimensioni, diventano altamente polarizzate e formano granuli lisomiali unici contenenti un modello specifico di proteine litiche.

La lisi delle cellule bersaglio tramite CTL procede attraverso una sequenza di passaggi programmati, tra cui il legame delle cellule bersaglio killer, la consegna del colpo letale, la lisi delle cellule bersaglio e il riciclaggio delle cellule killer. Dopo il riconoscimento dell’antigene appropriato, il CTL si lega saldamente alla superficie della cellula bersaglio, un evento che dipende dalla presenza di Mg2+ ma non Ca2+., La successiva lisi delle cellule bersaglio è mediata da due diversi meccanismi: esocitosi delle proteine litiche e/o legame recettore-ligando delle molecole Fas / APO. Le varie vie possono provocare diversi tipi di morte cellulare bersaglio: necrosi e apoptosi. Qui, i diversi meccanismi di uccisione di CTL sono descritti in modo più dettagliato.

I lisosomi di CTL hanno una morfologia unica che può essere vista solo con la microscopia elettronica (13). Ogni granulo ha un nucleo elettrone-denso circondato da piccole vescicole rotonde., All’interno del nucleo, diversi tipi di proteine litiche sono immagazzinati in una forma inattiva. Quando le cellule bersaglio dell’effettore si legano, i lisosomi sono diretti verso l’area di contatto mediante il riorientamento del centro di organizzazione dei microtubuli. Successivamente, il contenuto dei granuli viene rilasciato nello spazio intercellulare tramite esocitosi. La citolisi della cellula bersaglio viene quindi mediata da due tipi di proteine litiche, perforina e granzimi, che agiscono da soli o in combinazione tra loro.

Percorso di perforazione.

Il percorso della perforina è mostrato in Fig. 1., La perforina è una proteina che forma pori di 70 kDa (6). È codificato da un gene a singola copia che si trova sul cromosoma 10 e contiene tre esoni. I geni della perforina umana e del topo mostrano un’omologia significativa e la trascrizione del gene può essere controllata in entrambe le specie da fattori regolatori cis e/o trans – agenti multipli simili. Inoltre, esistono distinte omologia di sequenza e reattività crociata immunologica tra perforina e componenti del complemento; in particolare, nella porzione centrale delle molecole (residui di amminoacidi 189-218)., Un’altra regione conservata situata tra i residui 356 e 366 è stata trovata per il tipo precursore del fattore di crescita epidermico. Esperimenti con peptidi sintetici e perforina ricombinante hanno rivelato che la porzione NH2-terminale della perforina è il dominio più importante per l’attività litica.

FIGURA 1. Presentazione schematica del meccanismo di uccisione mediato dai linfociti T citotossici (CTL). La perforina (barre) ed i granzymes (ovali) sono immagazzinati insieme all’interno dei lisosomi di CTL e secernuti via l’esocitosi nella direzione della cellula bersaglio., La perforina è inserita nella membrana cellulare dell’obiettivo come monomero e successivamente forma i pori della membrana via la polimerizzazione. I granzimi entrano nelle cellule bersaglio attraverso i pori della perforina o attraverso l’endocitosi. Fas/APO-L è espresso all’interno della membrana CTL come molecola omotrimerica e quindi induce il clustering sul legame con il recettore Fas / APO (R) della cellula bersaglio. La via Fas / APO è innescata dal reclutamento di proteine citoplasmatiche (FADD-MORT TRADD, RIP) che si legano al dominio di morte Fas/APO-R., Fas / APO e granzymes sembrano avere una via comune per l’induzione dell’apoptosi delle cellule bersaglio mediante l’attivazione di proteasi simili all’enzima di conversione dell’interleuchina-1 (ICE). MHC, complesso maggiore di istocompatibilità.

Dopo la sintesi nel reticolo endoplasmatico grezzo, le molecole di perforina sono presumibilmente modificate posttranslazionalmente dalla N-glicolisi e sono immagazzinate nella matrice densa del nucleo dei lisosomi CTL come monomeri. I monomeri di perforina rilasciati vengono quindi inseriti nella membrana delle cellule bersaglio., Sebbene i recettori postulati per la perforina non siano ancora stati trovati, vi sono alcune prove che le parti di fosforilcolina fungano da molecole leganti (12). Nella fase successiva, i monomeri perforinici legati alla membrana polimerizzano e formano pori con un diametro medio di 16 nm (10). I pori assomigliano a quello del complesso di attacco della membrana del complemento; questi ultimi, tuttavia, sono più piccoli di diametro (~10 nm) e sono costituiti da diversi componenti del complemento (C5b, C6, C7, C8 e C9)., La morte della cellula bersaglio tramite perforina è mediata dall’afflusso incontrollato di piccole molecole come Ca2+ dal fluido extracellulare o dall’induzione dello stress osmotico, che si traduce in lisi osmotica colloidale. Inoltre, i pori della perforina possono fungere da condotto per altre proteine che uccidono CTL come i granzimi (8).

La morfologia dell’uccisione mediata dalla perforina è caratterizzata dalla necrosi delle cellule bersaglio (Fig. 2 bis e 3). Destabilizzazione della membrana, che può essere identificata mediante microscopia ottica con test di esclusione del colorante (Fig. 2a) o microscopia elettronica a trasmissione (Fig., 3), è l’indicazione iniziale della morte delle cellule bersaglio. Il gonfiore degli organelli e la rottura del citoscheletro sono le fasi successive della morte necrotica, ma il nucleo rimane intatto per un tempo prolungato. Infine, la cellula bersaglio si dissolve completamente, formando detriti cellulari con organelli residui e frammenti di membrana.

FIGURA 2. Aspetto microscopico leggero dell’interazione tra CTL (asterischi) e cellule di melanoma., I campioni sono stati etichettati con sulfo-NHS-biotina (rosso), che entra nelle cellule solo dopo il danno della membrana, e successivamente macchiato con il metodo di etichettatura del DNA 3′-end (verde, colorazione Tunel), che consente di rilevare la frammentazione del DNA. Le cellule sono state quindi esaminate con un microscopio laser confocale. Riga superiore: immagine di contrasto dell’interfaccia differenziale; riga inferiore: immagine di fluorescenza corrispondente. a e a’: Il citoplasma della cellula del melanoma mostra un’intensa etichettatura con sulfo-NHS-biotina, indicando danni alla membrana, ma nessuna colorazione di Tunel è rilevabile; questa morfologia è caratteristica per la necrosi., b e b’: Il nucleo della cellula del melanoma è distintamente macchiato dal metodo Tunel, ma il citoplasma non è etichettato con sulfo-NHS-biotina, che è caratteristica per l’apoptosi precoce. c e c’: Citoplasma della cellula del melanoma è diffusamente macchiato con sulfo-NHS-biotina, e frammenti nucleari sono intensamente etichettati con il metodo Tunel, un aspetto morfologico tipico per apoptosi tardiva. Ingrandimento: ×700 (a e b) e ×800 (c).

FIGURA 3. Necrosi CTL-mediata della cellula bersaglio., CTL (asterisco) è in stretto contatto con la cellula del melanoma, che mostra una rottura distinta della membrana cellulare e gonfiore degli organelli, mentre il nucleo sembra essere intatto. Ingrandimento = ×5.800.

Recenti studi su topi con carenza di perforina (knockout) hanno confermato l’importante ruolo della perforina per la citolisi cellulo-mediata sia in vitro che in vivo (4,7). Le cellule CTL e natural killer di topi con carenza di perforina non sono in grado di lisare cellule bersaglio allogeniche e cellule tumorali., Inoltre, questi animali non possono eliminare le infezioni del virus della coriomeningite linfocitica e non sono in grado di respingere le cellule tumorali allo e xenografted. Questi risultati mostrano inequivocabilmente che il meccanismo della perforina è attivo anche in condizioni in vivo. Tuttavia, CTL perforina-carenti non sono completamente inattivi, ma mostrano capacità litica residua che può essere mediata da altre vie.

Granzymes.

I granzimi sono un gruppo di serine esterasi con attività simile alla tripsina e all’asparaginasi, rispettivamente (8)., Ci sono almeno tre tipi di granzymes (A, B ed H) in CTL umano con una massa molecolare che varia fra 27 e 60 kDa. Sono altamente glicosilati e antigeneticamente correlati, come dimostrato dal loro alto grado di cross-reattività. I vari tipi di granzymes sono immagazzinati all’interno della matrice granulare dei lisosomi di CTL, insieme alla perforina e sono secreti via esocitosi nella direzione della cellula bersaglio nell’uccisione CTL-mediata. All’interno delle cellule bersaglio, i granzimi inducono la frammentazione del DNA a livello internucleosomiale, con conseguente morte cellulare apoptotica (3).,

Le alterazioni morfologiche iniziali dell’apoptosi mediata da CTL si verificano all’interno del nucleo (Fig. 2b e 4a), che è caratterizzato dalla condensazione di eterocromatina in depositi simili a macchie o crescenti lungo l’involucro nucleare, mentre gli organelli cellulari appaiono invariati. Inoltre, più bleb di membrana sono rilevabili sulla superficie cellulare, che possono essere rilasciati nello spazio intercellulare (Fig. 4 ter)., Le fasi successive della morte cellulare apoptotica sono definite morfologicamente dalla frammentazione del nucleo in piccoli corpi rotondi o ovali seguiti dalla completa distruzione della cellula bersaglio(Fig. 2 quater).

FIGURA 4. Ultrastruttura dell’apoptosi mediata da CTL. a: Il CTL (asterisco) sporge profondamente nel citoplasma della cellula del melanoma. Nota condensazione eterocromatina e frammentazione del nucleo cellulare bersaglio. Ingrandimento = ×5.800., b: Mediante microscopia elettronica a scansione, più bleb sono rilevabili sulla superficie della cellula del melanoma, mentre CTL (asterischi) mostrano solo brevi increspature della membrana. Ingrandimento = ×4.200.

In contrasto con la forma classica di apoptosi, che, ad esempio, si verifica come la morte programmata delle cellule nella fase prenatale differenziazione, il CTL-mediata frammentazione del DNA progredisce rapidamente, cioè, in pochi minuti, ed è indipendente dalla sintesi di nuove proteine nelle cellule bersaglio. La via per l’uccisione mediata da granzyme non è completamente nota., I granzimi stessi non sono efficaci nell’uccisione della cellula bersaglio, come dimostrato dagli esperimenti di trasfezione e negli studi che utilizzano il granzima A o B purificato.Si suggerisce quindi che i granzimi entrino nella cellula bersaglio attraverso i pori della perforina e siano solo allora in grado di agire intracellulare. All’interno delle cellule bersaglio, possono promuovere la degradazione del DNA scindendo gli istoni, con conseguente accesso più facile delle desossiribonucleasi al nucleo., Tuttavia, sempre più prove indicano che i granzimi sono anche indirettamente coinvolti nella degradazione del DNA legandosi a proteine nucleari come la nucleolina, che successivamente scinde il DNA, o attivando la via dell’enzima di conversione IL-1 (ICE) verso l’alto o verso valle (11). Se quest’ultimo è il caso, allora granzymes innescherebbe una via apoptotica intracellulare simile a quella postulata per l’uccisione CTL mediata dal ligando del recettore.,

La citolisi mediata dal recettore-ligando (via Fas/APO)

I CTL attivati sopportano uno specifico ligando Fas/APO (Fas / APO-L), chiamato anche CD95-ligando, che viene espresso in seguito al riconoscimento dell’antigene mediante sintesi de novo o mediante trasformazione di una forma inattiva in attiva (1). Fas / APO-L è una molecola transmembrana di tipo II 40-kDa. Appartiene alla superfamiglia del fattore di necrosi tumorale (TNF), che comprende anche TNF-α, linfotossina (LT)-α, LT-β, OX40-L, CD40-L, CD27-L e CD30-L., Queste molecole esistono come proteine trimeriche legate alla membrana e sono caratterizzate da omologia parziale della regione aminoacidica COOH-terminale all’interno dello spazio extracellulare. Il corrispondente recettore Fas/APO (Fas/APO-R, CD95-R) è una glicoproteina 48-kDa transmembrana. È espresso su una varietà di cellule ed è sovraregolato in cellule rapidamente proliferanti, ad esempio linfociti e cellule tumorali. Il Fas / APO-R ha un dominio citoplasmatico di 65 aminoacidi che è suggerito per essere responsabile della generazione del segnale di morte delle cellule bersaglio ed è quindi chiamato ” dominio della morte.,”Il dominio di morte di Fas ” APO-R è altamente omologa a quella del recettore TNF-α e, apparentemente, una sovrapposizione funzionale esiste tra entrambi i recettori. Poiché i domini di morte non hanno alcuna funzione catalitica, si suggerisce che le proteine citoplasmatiche siano reclutate seguendo il legame del ligando del recettore e utilizzate come messaggeri a valle per la morte. In effetti, sono state recentemente trovate diverse proteine associate al dominio della morte (TRADD, FADD/MORT-1 e RIP) che potrebbero essere responsabili della trasduzione del segnale (2).,

L’interazione del recettore del ligando Fas / APO provoca l’apoptosi tipica della cellula bersaglio, che è morfologicamente indistinguibile da quella della morte cellulare mediata da granzyme. La via intracellulare per l’induzione dell’apoptosi mediata da Fas non è completamente nota. Tuttavia, vi è una crescente evidenza che le proteasi citoplasmatiche sono coinvolte nella regolazione e nell’esecuzione dell’apoptosi (9), poiché un certo numero di proteine, tra cui poli(ADP-ribosio)polimerasi, lamina B1, α-fodrin, β-actina e topoisomerasi I, sono stati trovati a degradarsi con l’inizio dell’apoptosi., In particolare, gli enzimi simili al GHIACCIO (una famiglia di proteinasi cisteiniche, ora chiamate caspasi), che sono stati originariamente rilevati nel nematode Caenorrhabditis elegans, potrebbero essere un componente centrale del macchinario di morte cellulare come dimostrato da esperimenti di espressione e inibizione. Così la via di Fas/APO potrebbe provocare una cascata amplificata della proteasi che poi innesca la frammentazione del DNA all’interno del nucleo.,

Recenti studi su topi con mutazione naturale in Fas/APO-L (ceppo gld) e Fas / APO-R (ceppo lpr) hanno rivelato un disturbo linfoproliferativo policlonale associato all’ingrossamento degli organi linfatici periferici (linfonodi, milza) e una malattia simile al lupus negli animali. Così la mancanza di una via funzionale di Fas/APO provoca la proliferazione incontrollata delle cellule di T dovuto un guasto nell’eliminazione da apoptosi., Si suggerisce quindi che in condizioni fisiologiche la via Fas/APO regola l’omeostasi delle popolazioni cellulari normali ed è particolarmente necessaria per il controllo della crescita e della differenziazione dei linfociti.

Conclusione

La citotossicità mediata da CTL è caratterizzata da diversi meccanismi litici diretti contro diverse strutture della cellula bersaglio (la membrana cellulare e il nucleo). La combinazione di perforina e granzymes aumenta significativamente la capacità litica di CTL., Le cellule bersaglio possono riparare i pori della perforina mediante endocitosi di frammenti di membrana, ma allo stesso tempo incorporano i granzimi che inducono la frammentazione del DNA. Il tipo di morte cellulare, necrosi o apoptosi, è apparentemente determinato dalla cellula bersaglio stessa e sembra dipendere dal ciclo cellulare e dal metabolismo della cellula bersaglio. La via di Fas/APO offre un’abilità litica supplementare di CTL che è usata per controllo della proliferazione delle cellule T. Vi sono prove crescenti dell’esistenza di ulteriori meccanismi litici mediati dai membri della famiglia del TNF (TNF-α e linfotossina-α/β) (5)., Questi meccanismi, tuttavia, mostrano una cinetica litica più lenta e possono essere efficaci solo quando i processi di uccisione dominanti sono inefficaci.

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