os linfócitos T Citotóxicos (CTL) são antigénio específico de células efetoras do sistema imune com a capacidade de lisar células-alvo, tais como células infectadas por vírus, allografted células, ou mesmo parasitas em um contato-dependente maneira. Como outros linfócitos T, CTL inicialmente diferenciam-se no timo, onde adquirem o receptor específico de células T (TCR), um heterodímero de 90-kDa composto por uma cadeia α de 40-50 kDa e uma cadeia β de 37-45 kDa ., O TCR está intimamente associado com a glicoproteína CD3, um complexo de três a cinco proteínas invariantes que são aparentemente responsáveis pela transdução do sinal. A maioria da CTL também tem moléculas CD8, que se pensa se ligarem reversivelmente ao receptor da célula alvo. Outras moléculas de superfície (CD2, CD28, molécula de aderência intracelular) parecem desempenhar um papel importante na ativação da LCT após o reconhecimento de antigénios através da TCR.

CTL são incapazes de reconhecer antigénios livres., Os antigénios são, portanto, inicialmente absorvidos por células específicas, tais como células dendríticas e células Langerhans, que processam e apresentam o antigénio na sua superfície juntamente com moléculas do principal complexo de histocompatibilidade de classe I (MHC I). Assim, a ligação antigénica da CTL é sempre restrita aos determinantes MHC correctos. O reconhecimento e ligação de antígenos são seguidos pela proliferação e diferenciação de CTL, um evento que é promovido por várias citocinas . A activação específica do antigénio da LCTC está associada a alterações morfológicas distintas., As células aumentam de tamanho, tornam-se altamente polarizadas, e formam grânulos lisomais únicos contendo um padrão específico de proteínas líticas.

A lise das células-alvo via CTL procede através de uma sequência de etapas programadas, incluindo a ligação entre as células-alvo assassinas, a entrega do hit letal, a lise das células-alvo e a reciclagem das células assassinas. Após o reconhecimento do antigénio apropriado, a CTL liga-se firmemente à superfície da célula alvo, um acontecimento que depende da presença de Mg2+ mas não de Ca2+., A lise subsequente das células-alvo é mediada por dois mecanismos diferentes: exocitose de proteínas líticas e/ou ligação ao receptor-ligante de moléculas Fas/APO. As várias vias podem resultar em diferentes tipos de morte das células alvo: necrose e apoptose. Aqui, os diferentes mecanismos de OCT são descritos em mais detalhes.

lisossomas de CTL têm uma morfologia única que pode ser vista apenas por microscopia electrónica (13). Cada grânulo tem um núcleo denso de elétrons rodeado por pequenas vesículas redondas., Dentro do núcleo, vários tipos de proteínas líticas são armazenados em uma forma inativa. Quando as células-alvo efetoras se ligam, os lisossomas são direcionados para a área de contato por reorientação do centro de organização microtúbulos. Subsequentemente, o teor dos grânulos é libertado no espaço intercelular através de exocitose. A citólise das células alvo é então mediada por dois tipos de proteínas líticas, a perforina e as granzimas, que actuam sozinhas ou em combinação umas com as outras.

via perforina.

a via perforina é mostrada na Fig. 1., A perforina é uma proteína formadora de poros de 70 kDa (6). Ele é codificado por um único gene de cópia que está localizado no cromossomo 10 e contém três exons. Os genes do rato e da perforina humana apresentam uma homologia significativa, e a transcrição do gene pode ser controlada em ambas as espécies por múltiplos factores regulamentares semelhantes cis e/ou trans – acting. Além disso, a homologia de sequência distinta e a reactividade cruzada imunológica existem entre os componentes perforina e complemento; em particular, na parte central das moléculas (resíduos de aminoácidos 189-218)., Outra região conservada localizada entre os resíduos 356 e 366 foi encontrada para o tipo precursor do fator de crescimento epidérmico. Experimentos usando peptídeos sintéticos e perforina recombinante revelaram que a porção terminal de NH2 da perforina é o domínio mais importante para a atividade lítica.

Depois de síntese em bruto, retículo endoplasmático, perforin moléculas são presumivelmente posttranslationally modificado por N-glycolyzation e são armazenadas no núcleo denso matriz de CTL lisossomos como monômeros. Os monómeros perforínicos libertados são então inseridos na membrana das células-alvo., Embora os receptores postulados para a perforina ainda não tenham sido encontrados, há algumas evidências de que as moléculas de fosforilcolina servem como moléculas de ligação (12). Na etapa seguinte, os monômeros perforínicos ligados à membrana polimerizam e formam poros com um diâmetro médio de 16 nm (10). Os poros assemelham-se ao complexo de ataque de membrana complementar; este último, no entanto, são menores em diâmetro (~10 nm) e são feitos por vários componentes de complemento (C5b, C6, C7, C8 e C9)., A morte da célula-alvo através da perforina é mediada quer pelo influxo descontrolado de pequenas moléculas como a Ca2+ do fluido extracelular, quer pela indução de stress osmótico, o que resulta em lise osmótica colóide. Além disso, os poros de perforina podem servir como um canal para outras proteínas que matam o CTL, como as granzimas (8).a morfologia da occisão mediada pela perforina é caracterizada pela necrose das células alvo (figos. 2a e 3). Desestabilização de membrana, que pode ser identificado por microscopia de luz com testes de exclusão de Corante(Fig. 2a) ou microscopia electrónica de transmissão (Fig., 3), é a indicação inicial da morte da célula-alvo. Inchaço das organelas e ruptura do citoesqueleto são os próximos estágios da morte necrótica, mas o núcleo permanece intacto por um longo tempo. Finalmente, a célula-alvo dissolve-se completamente, formando detritos celulares com organelas residuais e fragmentos de membrana.

estudos recentes com ratinhos com deficiência de perforina (knockout) confirmaram o importante papel da perforina na citólise mediada pelas células, tanto in vitro como in vivo (4,7). O CTL e as células assassinas naturais de ratinhos com deficiência em perforina não são capazes de Liar as células alvo alogénicas e as células tumorais., Além disso, estes animais não conseguem eliminar infecções do vírus da coriomeningite linfocítica e são incapazes de rejeitar células tumorais allo – e xenograftadas. Estes resultados mostram inequivocamente que o mecanismo da perforina também é activo em condições in vivo. Contudo, a CTL com insuficiência de perforina não é completamente inactiva, mas apresenta capacidade lítica residual que pode ser mediada por outras vias.

Granzimas.as Granzimas são um grupo de serinas esterases com actividade semelhante à tripsina e à asparaginase, respectivamente (8)., Existem pelo menos três tipos de granzimas (A, B E H) no CTL humano com uma massa molecular variando entre 27 e 60 kDa. São altamente glicosiladas e antigeneticamente relacionadas, como demonstrado pelo seu elevado grau de reactividade cruzada. Os vários tipos de granzimas são armazenados dentro da matriz granular dos lisossomas CTL, juntamente com a perforina, e eles são secretados via exocitose na direção da célula-alvo na Matança mediada por CTL. Dentro das células-alvo, as granzimas induzem a fragmentação do ADN ao nível internucleossómico, resultando na morte de células apoptóticas (3).,as alterações morfológicas iniciais da apoptose mediada por CTL ocorrem dentro do núcleo (figos. 2b e 4a), que se caracteriza pela condensação da heterocromatina em depósitos em forma de ponto ou crescendo ao longo do envelope nuclear, enquanto as organelas celulares parecem inalteradas. Além disso, são detectáveis na superfície celular múltiplas membranas, que podem ser libertadas no espaço intercelular (Fig. 4b)., Os passos subsequentes da morte das células apoptóticas são morfologicamente definidos pela fragmentação do núcleo em pequenos corpos redondos ou ovais, seguida pela destruição completa da célula-alvo (Fig. 2c).

Em contraste com a forma clássica de apoptose, o que, por exemplo, ocorre como morte celular programada durante o pré-natal diferenciação, o CTL-mediada da fragmentação do DNA progride rapidamente, por exemplo, dentro de minutos, e é independente da síntese de novas proteínas nas células-alvo. A via para a occisão mediada por granzyme não é completamente conhecida., As próprias granzimas não são eficazes na occisão das células-alvo, como demonstrado por experiências de transfecção e em estudos que utilizam granzima a purificada ou B. sugere-se, portanto, que as granzimas entram na célula-alvo através de poros perfurados e só então são capazes de actuar intracelularmente. Dentro das células-alvo, podem promover a degradação do ADN através da clivagem de histonas, resultando num acesso mais fácil das desoxirribonucleases ao núcleo., No entanto, cada vez mais evidências indicam que as granzimas também estão indiretamente envolvidas na degradação do DNA por ligação a proteínas nucleares, como a nucleolina, que subsequentemente cliveia o DNA, ou ativando a via da enzima de conversão IL-1 (gelo) para cima ou para baixo (11). Se este último for o caso, então as granzimas desencadeariam uma via apoptótica intracelular semelhante à postulada para a Oct mediada pelo receptor ligando.,

citólise mediada pelo receptor-ligando (via Fas/APO)

CTL activada apresentam um ligando Fas/APO específico (Fas / APO-L), também chamado ligando CD95, que é expresso após o reconhecimento do antigénio quer por síntese de novo quer por transformação de um inactivo para uma forma activa (1). Fas / APO-L é uma molécula transmembranar de 40 kDa tipo II. Pertence à superfamília do factor de necrose tumoral (TNF), que também inclui TNF-α, linfotoxina (LT)-α, LT-β, OX40-L, CD40-L, CD27-L E CD30-L., Estas moléculas existem como proteínas ligadas à membrana trimeric e são caracterizadas pela homologia parcial da região do aminoácido COOH-terminal dentro do espaço extracelular. O receptor Fas/APO correspondente (Fas/APO-R, CD95-R) é uma glicoproteína transmembranar de 48 kDa. É expressa em uma variedade de células e é upregulada em células em rápida proliferação, por exemplo, linfócitos e células tumorais. O Fas/APO-R tem um domínio citoplásmico de 65 aminoácidos que é sugerido ser responsável pela geração do sinal de morte da célula alvo e é, portanto, chamado de “domínio da morte”., O domínio da morte de Fas / APO-R é altamente homólogo ao do receptor TNF-α e, aparentemente, existe uma sobreposição funcional entre ambos os receptores. Como os domínios da morte não têm função catalítica, sugere-se que as proteínas citoplasmáticas são recrutadas seguindo a ligação do ligante receptor e utilizadas como mensageiros a jusante para a morte. Na verdade, várias proteínas associadas ao Domínio da morte foram recentemente encontradas (TRADD, FADD/MORT-1, e RIP) que podem ser responsáveis pela transdução do sinal (2).,a interacção do receptor do ligante Fas/APO resulta em apoptose típica da célula alvo, que é morfologicamente indistinguível da morte celular mediada pela granzyme. A via intracelular de indução da apoptose mediada pelo Fas não é completamente conhecida. No entanto, há cada vez mais evidências de que as proteases citoplásmicas estão envolvidas na regulação e execução da apoptose (9), uma vez que várias proteínas, incluindo poli(ADP-ribose)polimerase, lamina B1, α-fodrina, β-actina e topoisomerase i, se descobriram degradadas com o início da apoptose., Em particular, enzimas semelhantes ao gelo (uma família de proteinases da cisteína, agora chamadas caspases), que foram originalmente detectadas no nematode caenorrhabditis elegans, podem ser um componente central da maquinaria de morte celular, como demonstrado por experiências de expressão e inibição. Assim, a via Fas/APO pode resultar numa cascata da protease amplificada que desencadeia a fragmentação do ADN no núcleo.,estudos recentes em ratinhos com mutação natural em Fas/APO-l (estirpe gld) e Fas/APO-R (estirpe lpr) revelaram uma doença linfoproliferativa policlonal associada ao aumento dos órgãos linfáticos periféricos (gânglios linfáticos, baço) e uma doença de lúpus nos animais. Assim, a falta de uma via funcional Fas / APO resulta na proliferação descontrolada de células T devido a uma falha na eliminação por apoptose., Sugere-se, portanto, que, em condições fisiológicas, a via Fas/APO regula a homeostase das populações celulares normais e é particularmente necessária para o controlo do crescimento e diferenciação dos linfócitos.

conclusão

CTL a citotoxicidade mediada é caracterizada por vários mecanismos líticos que são dirigidos contra diferentes estruturas da célula alvo (membrana celular e núcleo). A combinação de perforina e granzimas aumenta significativamente a capacidade lítica da CTL., As células alvo podem reparar poros de perforina através da endocitose de fragmentos de membrana, mas ao mesmo tempo incorporam granzimas que induzem a fragmentação do ADN. O tipo de morte celular, necrose ou apoptose, é aparentemente determinado pela própria célula-alvo e parece depender do ciclo celular e metabolismo da célula-alvo. A via Fas / APO oferece uma capacidade lítica adicional de CTL que é utilizada para o controlo da proliferação de células T. Existe uma evidência crescente da existência de outros mecanismos líticos mediados pelos membros da família TNF (TNF-α e linfotoxina-α/β) (5)., Estes mecanismos, no entanto, mostram uma cinética lítica mais lenta e podem ser eficazes apenas quando os processos de occisão dominantes são ineficazes.