limfocite T Citotoxice (CTL) sunt antigen-specifice celulelor efectoare ale sistemului imunitar cu capacitatea de a lizeze celulele țintă, cum ar fi celulele infectate cu virus, allografted celule, sau chiar paraziți într-un contact manieră dependentă. Ca și alte limfocite T, CTL se diferențiază inițial în timus, unde dobândesc receptorul specific al celulelor T (TCR), un heterodimer 90-kDa compus dintr-un lanț α de 40-50 kDa și un lanț β de 37-45 kDa ., TCR este strâns asociat cu glicoproteina CD3, un complex de trei până la cinci proteine invariante care sunt aparent responsabile pentru transducția semnalului. Majoritatea CTL poartă, de asemenea, molecule CD8, despre care se crede că se leagă reversibil de receptorul celular țintă. Alte molecule de suprafață (CD2, CD28, molecula de adeziune intracelulară) par să joace un rol important în activarea CTL după recunoașterea antigenului prin TCR.CTL sunt incapabile să recunoască antigene libere., Prin urmare, antigenii sunt inițial absorbiți de celule specifice, cum ar fi celulele dendritice și celulele Langerhans, care procesează și prezintă antigenul la suprafața lor împreună cu moleculele complexului de histocompatibilitate majoră din clasa I (MHC I). Astfel, legarea antigenului CTL este întotdeauna limitată la determinanții MHC corecți. Recunoașterea și legarea antigenului sunt urmate de proliferarea și diferențierea CTL, un eveniment care este promovat de diverse citokine . Activarea specifică antigenului CTL este asociată cu modificări morfologice distincte., Celulele cresc în dimensiune, devin foarte polarizate și formează granule lizomale unice care conțin un model specific de proteine litice.
liza celulelor țintă prin CTL se desfășoară printr-o secvență de pași programați, incluzând legarea celulelor țintă ucigașe, livrarea loviturii letale, liza celulelor țintă și reciclarea celulelor ucigașe. După recunoașterea antigenului adecvat, CTL se leagă ferm de suprafața celulei țintă, un eveniment care depinde de prezența Mg2+, dar nu de Ca2+., Liza ulterioară a celulelor țintă este mediată de două mecanisme diferite: exocitoza proteinelor litice și/sau legarea receptorilor-ligand a moleculelor Fas/APO. Diferitele căi pot duce la diferite tipuri de moarte celulară țintă: necroză și apoptoză. Aici, diferitele mecanisme de ucidere ale CTL sunt descrise mai detaliat.lizozomii CTL au o morfologie unică care poate fi văzută numai prin microscopie electronică (13). Fiecare granulă are un miez dens de electroni înconjurat de vezicule mici, rotunde., În miez, mai multe tipuri de proteine litice sunt stocate într-o formă inactivă. Când celulele țintă efectoare se leagă, lizozomii sunt direcționați spre zona de contact prin reorientarea Centrului de organizare a microtubulilor. Ulterior, conținutul granulelor este eliberat în spațiul intercelular prin exocitoză. Citoliza celulei țintă este apoi mediată de două tipuri de proteine litice, perforina și granzimele, care acționează fie singure, fie în combinație între ele.
calea Perforinei.
calea perforinei este prezentată în Fig. 1., Perforina este o proteină care formează porii de 70 kDa (6). Este codificat de o singură genă de copie care este localizată pe cromozomul 10 și conține trei exoni. Mouse-ul și umane perforin gene display semnificative omologie, și transcrierea genei poate fi controlat de la ambele specii similare de mai multe cis și/sau trans-acționează factori de reglementare. În plus, distincte omologia de secvență și imunologice reactivitate încrucișată există între perforin și componentelor complementului; în special, în porțiunea centrală a moleculelor (resturi de aminoacizi 189-218)., O altă regiune conservată situată între reziduurile 356 și 366 a fost găsită pentru tipul precursor al factorului de creștere epidermal. Experimentele cu peptide sintetice și perforină recombinantă au arătat că porțiunea NH2-terminală a perforinei este cel mai important domeniu pentru activitatea litică.
FIGURA 1. Prezentarea schematică a mecanismului de ucidere mediat de limfocitele T citotoxice (CTL). Perforina (bars) și granzimele (ovale) sunt stocate împreună în lizozomii CTL și secretate prin exocitoză în direcția celulei țintă., Perforin este introdus în membrana celulei țintă ca monomer și formează ulterior porii membranei prin polimerizare. Granzimele intră în celulele țintă prin porii perforinei sau prin endocitoză. Fas / APO-L este exprimat în membrana CTL ca moleculă homotrimerică și astfel induce gruparea la legarea la receptorul Fas / APO (R) al celulei țintă. Calea Fas / APO este declanșată de recrutarea de proteine citoplasmatice (FADD-MORT TRADD, RIP) care se leagă de domeniul morții Fas/APO-R., Fas / APO și granzimele par să aibă o cale comună pentru inducerea apoptozei celulelor țintă prin activarea proteazelor asemănătoare enzimei de conversie interleukină-1 (ICE). MHC, complex major de histocompatibilitate.
După sinteza în reticulului endoplasmatic dur, perforin molecule sunt probabil posttranslationally modificat de N-glycolyzation și sunt stocate în miezul dens matrice de CTL lizozomi sub formă de monomeri. Monomerii perforin eliberați sunt apoi introduși în membrana celulelor țintă., Deși receptorii postulat de perforin nu au fost încă găsite, există unele dovezi că phosphorylcholine moieties servi ca molecule de legare (12). În etapa următoare, monomerii perforinici legați de membrană polimerizează și formează pori cu un diametru mediu de 16 nm (10). Porii seamănă cu cel al complexului de atac al membranei complementului; acestea din urmă, cu toate acestea, sunt mai mici în diametru (~10 nm) și sunt realizate de mai multe componente ale complementului (C5b, C6, C7, C8 și C9)., Moartea celulei țintă prin perforină este mediată fie de influxul necontrolat de molecule mici, cum ar fi Ca2+ din fluidul extracelular, fie prin inducerea stresului osmotic, ceea ce duce la liza osmotică coloidală. Mai mult, porii perforinei pot servi ca o conductă pentru alte proteine care ucid CTL, cum ar fi granzymes (8).morfologia uciderii mediate de perforină se caracterizează prin necroza celulelor țintă (Fig. 2a și 3). Destabilizarea membranei, care poate fi identificată fie prin microscopie luminoasă cu teste de excludere a colorantului (Fig. 2a) sau microscopie electronică de transmisie (Fig., 3), este indicația inițială a morții celulelor țintă. Umflarea organelor și întreruperea citoscheletului sunt următoarele etape ale morții necrotice, dar nucleul rămâne intact pentru o perioadă lungă de timp. În cele din urmă, celula țintă se dizolvă complet, formând resturi celulare cu organele reziduale și fragmente de membrană.
FIGURA 2. Apariția microscopică ușoară a interacțiunii dintre CTL (asteriscuri) și celulele melanomului., Probele au fost etichetate cu sulfo-NHS-biotină (roșu), care intră în celule numai după deteriorarea membranei și ulterior colorate cu metoda de etichetare a ADN-ului 3′(colorare verde, Tunel), care permite detectarea fragmentării ADN-ului. Celulele au fost apoi examinate cu un microscop laser confocal. Rândul de sus: imagine de contrast a interfeței diferențiale; rândul de Jos: imagine fluorescentă corespunzătoare. a și a’: citoplasma celulei melanomului prezintă o etichetare intensă cu sulfo-NHS-biotină, indicând deteriorarea membranei, dar nu este detectabilă colorarea tunelului; această morfologie este caracteristică necrozei., B și b’: nucleul celulei melanomului este colorat distinct prin metoda Tunel, dar citoplasma nu este etichetată cu sulfo-NHS-biotină, caracteristică apoptozei timpurii. C și c’: citoplasma celulei melanomului este colorată difuz cu sulfo-NHS-biotină, iar fragmentele nucleare sunt etichetate intens cu metoda Tunel, aspect morfologic tipic pentru apoptoza târzie. Mărire: ×700 (a și b) și ×800 (c).
FIGURA 3. Necroza mediată de CTL a celulei țintă., CTL (asterisc) este în contact strâns cu celula melanom, care arată perturbarea distinctă a membranei celulare și umflarea organite, în timp ce nucleul pare a fi intact. Mărire = ×5.800.
studii Recente cu perforin-deficit (knock-out), soareci, a confirmat rolul important al perforin pentru mediată celular citoliza atât in vitro cât și in vivo (4,7). CTL și celulele ucigașe naturale ale șoarecilor cu deficit de perforină nu sunt capabili să lizeze celulele țintă alogene și celulele tumorale., În plus, aceste animale nu pot elimina infecțiile cu virusul choriomeningitei limfocitare și nu sunt în măsură să respingă celulele tumorale Alo – și xenogrefe. Aceste rezultate arată fără echivoc că mecanismul perforin este, de asemenea, activ în condiții in vivo. Cu toate acestea, CTL cu deficit de perforin nu sunt complet inactive, dar prezintă o capacitate litică reziduală care poate fi mediată de alte căi.
Granzymes.
Granzimele sunt un grup de esteraze serinice cu activitate asemănătoare tripsinei și asparaginazei (8)., Există cel puțin trei tipuri de granzime (A, B și H) în CTL uman cu o masă moleculară variind între 27 și 60 kDa. Acestea sunt foarte glicozilate și legate antigenetic, așa cum demonstrează gradul lor ridicat de reactivitate încrucișată. Diferitele tipuri de granzime sunt stocate în matricea granulară a lizozomilor CTL, împreună cu perforina, și sunt secretate prin exocitoză în direcția celulei țintă în uciderea mediată de CTL. În celulele țintă, granzimele induc fragmentarea ADN – ului la nivel internucleozomal, ducând la moartea celulelor apoptotice (3).,modificările morfologice inițiale ale apoptozei mediate de CTL apar în interiorul nucleului (Fig. 2B și 4a), care se caracterizează prin condensarea heterocromatinei în depozite spot – sau Crescent de-a lungul plicului nuclear, în timp ce organele celulare apar neschimbate. Mai mult, mai multe bleburi membranare sunt detectabile la suprafața celulei, care pot fi eliberate în spațiul intercelular (Fig. 4b)., Etapele ulterioare ale morții celulare apoptotice sunt definite morfologic prin fragmentarea nucleului în corpuri mici rotunde sau ovale, urmate de distrugerea completă a celulei țintă (Fig. 2c).
FIGURA 4. Ultrastructura apoptozei mediate de CTL. R: CTL (asterisc) iese adânc în citoplasma celulei melanomului. Notă condensarea heterocromatinei și fragmentarea nucleului celulei țintă. Mărire = ×5.800., b: prin microscopie electronică de scanare, mai multe bleb – uri sunt detectabile la suprafața celulei melanomului, în timp ce CTL (asteriscuri) prezintă doar volane cu membrană scurtă. Mărire = ×4.200.spre deosebire de forma clasică de apoptoză, care, de exemplu, apare ca moarte celulară programată în timpul diferențierii prenatale, fragmentarea ADN mediată de CTL progresează rapid, adică în câteva minute, și este independentă de sinteza proteinelor noi în celulele țintă. Calea pentru uciderea mediată de granzyme nu este complet cunoscută., Granzymes ei înșiși nu sunt eficiente în celula țintă uciderea, așa cum se arată prin transfecție experimente și studii folosind purificat granzyme a sau B. prin urmare, este sugerat că granzymes intre celula țintă prin intermediul perforin porii și doar apoi să acționeze intracelular. În celulele țintă, ele pot promova degradarea ADN-ului prin scindarea histonelor, rezultând un acces mai ușor al dezoxiribonucleazelor la nucleu., Cu toate acestea, mai multe și mai multe dovezi indică faptul că granzymes sunt, de asemenea, indirect implicate în degradarea ADN-ul fie prin legarea de proteine nucleare, cum ar fi nucleolin, care ulterior scindează ADN-ul, sau activarea IL-1-enzimei de conversie (ICE) calea amonte sau în aval (11). Dacă acesta din urmă este cazul, atunci granzymes ar declanșa o cale apoptotică intracelulară similară, așa cum este postulată pentru uciderea CTL mediată de ligand receptor.,
citoliza mediată de ligand Receptor (calea Fas/APO)
CTL activat poartă un ligand specific Fas/APO (Fas / APO-l), numit și ligand CD95, care este exprimat în urma recunoașterii antigenului fie prin sinteza de novo, fie prin transformarea unei forme inactive într-o formă activă (1). Fas / APO-L este o moleculă transmembranară de tip 40-kDa ii. Ea aparține factorului de necroză tumorală (TNF) superfamiliei, care include, de asemenea, TNF-α, limfotoxina (LT)-α, LT-β, OX40-L, CD40-L, CD27-L, și CD30-L., Aceste molecule există ca proteine legate de membrana trimerică și se caracterizează prin omologia parțială a regiunii de aminoacizi COOH-terminal din spațiul extracelular. Receptorul FAS/APO corespunzător (Fas/APO-R, CD95-R) este o glicoproteină transmembranară 48-kDa. Acesta este exprimat pe o varietate de celule și este upregulated în celulele proliferante rapid, de exemplu, limfocite și celule tumorale. Fas / APO-R are un domeniu citoplasmatic 65-aminoacid care este sugerat să fie responsabil pentru generarea semnalului de moarte a celulelor țintă și, prin urmare, este numit „domeniul morții.,”Domeniul morții Fas / APO-R este foarte omolog cu cel al receptorului TNF-α și, aparent, există o suprapunere funcțională între ambii receptori. Deoarece domeniile morții nu au funcție catalitică, se sugerează că proteinele citoplasmatice sunt recrutate în urma legării ligandului receptorilor și utilizate ca mesageri în aval pentru moarte. Într-adevăr, au fost găsite recent mai multe proteine asociate domeniului morții (TRADD, FADD/MORT-1 și RIP) care ar putea fi responsabile pentru transducția semnalului (2).,interacțiunea receptorului ligand Fas / APO are ca rezultat apoptoza tipică a celulei țintă, care este indistinguizabilă morfologic de cea a morții celulare mediate de granzyme. Calea intracelulară pentru inducerea apoptozei mediate de Fas nu este complet cunoscută. Cu toate acestea, există tot mai multe dovezi că citoplasmatice proteazele sunt implicate în reglementarea și execuție a apoptozei (9), deoarece un număr de proteine, inclusiv poli(ADP-riboză)polimerazei, lamin B1, α-fodrin, β-actina, și topoizomeraza I, au fost găsite pentru a deveni degradat odată cu debutul de apoptoza., În special, GHEATA, ca enzime (o familie de cisteina-proteinaze, acum numite caspaze), care inițial au fost detectate în nematode Caenorrhabditis elegans, ar putea fi o componentă centrală de celule moarte utilaje așa cum se arată de exprimare și inhibarea experimente. Astfel, calea Fas / APO ar putea duce la o cascadă de protează amplificată care declanșează apoi fragmentarea ADN-ului în nucleu.,studiile recente pe șoareci cu mutații naturale în Fas/APO-l (tulpina gld) și Fas / APO-r (tulpina lpr) au evidențiat o tulburare limfo-proliferativă policlonală asociată cu mărirea organelor limfatice periferice (ganglioni limfatici, splină) și o boală asemănătoare lupusului la animale. Astfel, lipsa unei căi funcționale Fas/APO duce la proliferarea necontrolată a celulelor T datorită eșecului în eliminarea prin apoptoză., Prin urmare, se sugerează că, în condiții fiziologice, calea Fas/APO reglează homeostazia populațiilor celulare normale și este necesară în special pentru controlul creșterii și diferențierii limfocitelor.citotoxicitatea mediată de CTL se caracterizează prin mai multe mecanisme litice care sunt îndreptate împotriva diferitelor structuri ale celulei țintă (membrana celulară și nucleul). Combinația dintre perforin și granzymes crește semnificativ capacitatea litică a CTL., Celulele țintă pot repara porii perforinei prin endocitoza fragmentelor de membrană, dar în același timp încorporează granzime care induc fragmentarea ADN-ului. Tipul de moarte celulară, necroză sau apoptoză, este aparent determinat de celula țintă în sine și pare să depindă de ciclul celular și de metabolismul celulei țintă. Calea Fas / APO oferă o capacitate litică suplimentară a CTL care este utilizată pentru controlul proliferării celulelor T. Există tot mai multe dovezi pentru existența unor mecanisme litice suplimentare mediate de membrii familiei TNF (TNF-α și limfotoxină-α/β) (5)., Cu toate acestea, aceste mecanisme prezintă o cinetică litică mai lentă și pot fi eficiente numai atunci când procesele dominante de ucidere sunt ineficiente.