AutoCellSeg: robusto automática de unidades formadoras de colónias (UFC)/célula de análise adaptativa de segmentação de imagens e de fácil utilização pós-técnicas de edição

Novembro 27, 2020

neste capítulo, os resultados do novo benchmark de dados que criamos e outros conjuntos de dados utilizados em trabalhos anteriores são apresentadas. AutoCellSeg foi comparado a outras ferramentas de software usando várias medidas de qualidade.,

novos dados de referência

rotulámos 12 imagens, que foram adquiridas nos nossos laboratórios, para a verdade do solo de diferentes espécies bacterianas (3 imagens cada), incluindo E. coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus. As imagens foram rotuladas por delinear os limites das colônias usando Adobe Photoshop e, em seguida, com MATLAB para criar imagens binárias rotuladas. Consequentemente, estas imagens da verdade do solo são usadas para extrair: (1) contagem de colônias (2) Tamanho de cada colônia individual em pixels.,os relatórios anteriores sobre a especificidade e sensibilidade das ferramentas utilizadas para a contagem de colónias baseiam-se predominantemente apenas na contagem total. Tal comparação dá uma visão menor sobre a plausibilidade das colônias, especialmente em termos do tamanho detectado. O tamanho de cada colônia poderia ser de igual importância em muitos experimentos. Por conseguinte, deve também ser incorporado um critério de qualidade baseado na precisão da segmentação. A medida de qualidade Q, baseada em 24, foi utilizada para avaliar o resultado do processo de segmentação (ver dados suplementares 1 Para mais detalhes)., Q leva em conta: diferença na contagem de segmentos em relação à verdade do solo (q1), e número de pixels de segmento desclassificados (q2).utilizando Q no novo parâmetro de referência, foram comparadas diferentes ferramentas(ver Fig. 2). Uma vez que tanto IJM e ImageJ Edge falha na presença de contêiner UFC na imagem, optamos por soluções alternativas como OpenCFU. Também desenvolvemos um pipeline personalizado em CellProfiler, baseado no trabalho feito por 8, e uma combinação de Ilastik e CellProfiler para comparação com AutoCellSeg., Enquanto AutoCellSeg extrai a área da placa de Petri automaticamente, CellProfiler e OpenCFU não. Em OpenCFU uma região de interesse (ROI) em forma de um círculo de 3 pontos ou polígono complexo é necessária para extrair a informação apenas presente dentro do recipiente. A função” Auto-Petri ” mencionada em 12 não está em nenhum lugar para ser visto em sua interface gráfica e nem funciona perfeitamente na parte de trás, uma vez que em vários resultados o ruído fora do prato foi segmentado. Um gasoduto separado foi usado para cada espécie e pode ser encontrado no repositório AutoCellSeg: https://github.com/AngeloTorelli/AutoCellSeg/tree/master/DATA/Benchmark., Por exemplo, o oleoduto CellProfiler e os resultados para E. coli podem ser encontrados sob sua própria pasta: https://github.com/AngeloTorelli/AutoCellSeg/tree/master/DATA/Benchmark/E. coli/CellProfiler. Devido à afinação manual de parâmetros e a seleção manual do prato perti, CellProfiler pode não ser a solução para alta produtividade e segmentação totalmente automatizada. O resultado da segmentação produzido pelo CellProfiler é bom para os conjuntos de dados de referência, por isso foi incluído para a comparação.,

a inclusão do Ilastik foi feita porque proporciona uma previsão razoável no sentido dos pixels utilizando a aprendizagem supervisionada pela máquina. Para cada espécie bacteriana, apenas uma imagem foi tomada para rotular pixels do fundo e colônias (dois problemas de classe) usando todas as características disponíveis até que a segmentação resultante estava perto da verdade do solo. Os resultados da segmentação foram exportados como arquivos tiff e, posteriormente, combinados com o gasoduto CellProfiler para quantificação.,

OpenCFU evita detecções falsas devido aos seus cuidadosos critérios de selecção de colónias. No OpenCFU o usuário tem que ter cuidado com o intervalo de tamanho da colônia para ser introduzido manualmente usando a barra deslizante. Se um raio menor muito pequeno é selecionado, OpenCFU produz um monte de falsos positivos, além de detectar o ruído dentro e fora do contêiner UFC. Inversamente, se um raio inferior for definido para um valor adequado (ou seja, 25-35 no caso de Staphylococcus aureus), a contagem de colónias é largamente subestimada., Um usuário primeiro tem que tentar valores diferentes para menor raio, a fim de obter um bom resultado de segmentação. A seleção desses valores pode ser trivial para o usuário experiente, mas mesmo assim, ele ainda requer tentativa e erro se diferentes conjuntos de dados com diferentes resoluções devem ser avaliados. Este problema é adequadamente corrigido em AutoCellSeg, onde o usuário apenas tem que clicar em uma colônia pequena e grande, como o raio inferior e superior são então extraídos automaticamente usando o método de marcha rápida.

A outra questão principal no OpenCFU é que não existe uma solução totalmente automatizada de transferência de lotes., Um utilizador tem de carregar manualmente na página’ > ‘ da interface gráfica para processar a imagem seguinte. Isso impede a sua capacidade de ser usado para conjuntos de dados maiores, mesmo quando os parâmetros globais para Segmentação/contagem poderiam ser definidos com segurança. Por outro lado, AutoCellSeg permite ser usado em um modo totalmente automatizado sem qualquer tipo de intervenção humana durante seu processo de execução.

tanto o OpenCFU como o AutoCellSeg foram operados em modo semi-automático (ver “Selecção do processo” em dados suplementares 2 para diferentes modos de operação)., Os resultados da segmentação foram obtidos como máscaras Binárias diretamente de AutoCellSeg e pipeline de celular. No entanto, no caso do OpenCFU, características utilizáveis para a comparação de qualidade necessária São centro e raio das colônias. Esta é outra desvantagem do OpenCFU, que não se pode obter uma máscara binária diretamente para a comparação da contagem/tamanho das colônias com a verdade do solo. Usando o centro e o raio das colônias, reconstruímos círculos binários para emular as colônias e usamos segmentação divisória de águas para separar as colônias sobrepostas., Isto foi feito para igualar o número e o tamanho das colônias como extraído do Software OpenCFU. Todas as três máscaras Binárias obtidas foram comparadas com a verdade do solo para a contagem total e tamanho das colônias usando Q.

alguns exemplos de resultados do novo conjunto de dados de imagem benchmark são mostrados na figura. 2. As cores Vermelho, Ciano, Azul e verde são usadas para representar CellProfiler, Ilastik + CellProfiler, OpenCFU e AutoCellSeg respectivamente. Em alguns casos, o CellProfiler fornece uma segmentação muito boa., Os resultados do Ilastik com o CellProfiler em operação em lote não foram drasticamente melhores do que o OpenCFU ou o CellProfiler. No entanto, a combinação dos dois produz resultados comparáveis ao AutoCellSeg ao rotular todas as imagens individualmente, mas vem à custa do tempo e do esforço de etiquetagem. AutoCellSeg ainda supera as outras soluções em termos de qualidade Q do resultado da segmentação. A comparação individual pode ser vista nos gráficos da Fig. 2., A comparação global entre AutoCellSeg, OpenCFU e CellProfiler e a combinação de Ilastik + Cellprofiler é dada na Tabela 1 usando um valor Q médio (Q m ) e um valor q1 médio (q1,m).

Table 1 Quality comparison of different methods using benchmark images.

Control/test analysis

Ao contrário de outras soluções de software de análise da UFC, AutoCellSeg tem a possibilidade de comparar diferentes modos de dados., Por exemplo, numa experiência microbiológica, pode ser necessário conhecer as alterações na morfologia da UFC e o número que ocorrem durante o tratamento. O teste foi irradiar as colônias com luz azul para observar as diferenças de tamanho e número de colônias. Portanto, AutoCellSeg pede ao Usuário para selecionar controle e testar imagens, a fim de fazer uma comparação experenciada. Por exemplo, escolhemos um conjunto de imagens de controle e teste de E. coli. Realiza-se um ensaio (isto é, irradiação de luz) para observar a alteração da dimensão da UFC no que diz respeito às imagens de controlo.,

Existem três pares de teste/controlo representados por números. As imagens são carregadas em AutoCellSeg e os parâmetros são ajustados como mostrado nos dados suplementares 3. O programa é então executado no modo semi-automático. A correção é feita em cada imagem individual e quando todas as imagens são processadas, o usuário pode optar por exibir gráficos de comparação. Os contornos do segmento (o resultado após a execução do processo) são os resultados da detecção AutoCellSeg. Os resultados de segmentação para todas as imagens são mostrados em: https://github.com/AngeloTorelli/AutoCellSeg/tree/master/DATA/control_test., Os contornos cianos representam a delimitação da UFC de controle e o vermelho representa os contornos do experimento de teste, dependendo da Convenção de nomenclatura. Para cada par de conjuntos de dados, uma função de estimativa de densidade de Kernel (KDE) é representada representando a distribuição de tamanho das colônias (em pixels), como mostrado na Fig. 3. A função devolve uma estimativa da densidade de probabilidade do tamanho da UFC. A estimativa é baseada em uma função de kernel normal, e é avaliada em pontos igualmente espaçados, x i,que cobrem a gama dos dados em X. Aqui, x é usado para descrever o tamanho da UFC A.,

No gráfico da Fig. 3, a curva verde mostra a distribuição do tamanho nas colónias de controlo e a curva tracejada a vermelho mostra a distribuição do tamanho das CFO após irradiação ligeira. A suavidade da curva é controlada por um parâmetro de largura de banda bw., Neste conjunto de dados, usamos bw = 2000. O uso de valores bw menores poderia resultar em curvas menos suaves e provavelmente mais de um pico dependendo da variância no tamanho de CFO. Os valores negativos no início do eixo dos x devem-se à extrapolação da função de alisamento no lado esquerdo do pico em x-data. Isto não indica a existência de Colónias com uma zona UFC negativa.

também é possível ver a mudança de área e contagem de CFO após experiências de teste. Em Fig. 4, o gráfico à esquerda mostra a alteração nas áreas da UFC após irradiação de luz., As áreas de controle estão normalizadas para 1. Cada cor é usada para representar uma experiência diferente. De um modo geral, verifica-se que as dimensões das UFC diminuem após a irradiação da luz, neste caso. O gráfico à direita da figura. 4 mostra a contagem absoluta de UFC tanto nas condições de controlo como de ensaio. Pode-se ver que a contagem média nesta sessão de experiência diminuiu. De forma similar, diferentes imagens de experimentos de controle e teste podem ser analisadas em AutoCellSeg.,

AutoCellSeg desenha automaticamente a informação a priori a partir dos exemplos de entrada, mesmo que as colónias tenham uma variação de tamanho consideravelmente elevada. Portanto, AutoCellSeg pode ser facilmente usado para outros conjuntos de dados., Isto também pode funcionar para diferentes estruturas celulares, mesmo quando não são muito redondas, já que AutoCellSeg leva em conta a excentricidade de objetos usando a entrada gráfica de conhecimento a priori. AutoCellSeg também extrai outras características a priori baseadas na intensidade, em caso de detecção de falsos positivos. Um exemplo de vídeo de utilização de AutoCellSeg para análise de pares de controlo/teste é dado nos dados suplementares 4.

A aplicação a outro conjunto de dados

AutoCellSeg foi aplicada a outros conjuntos de dados de imagens com colónias., É razoável tentar um conjunto de dados de imagens bem segmentadas com um fundo e primeiro plano diferente, a fim de mostrar a robustez de AutoCellSeg. Além disso, é também imperativo demonstrar o desempenho da AutoCellSeg em diferentes modos de operação. Foi também demonstrado o desempenho do AutoCellSeg em Segmentação celular fluorescente de mamíferos e em dados de lote e em imagens seleccionadas aleatoriamente (ver dados suplementares 5).,

fundo invertido

um desafio seria usar um conjunto de dados com um fundo claro com colônias mais escuras em primeiro plano para ver se o software pode se adaptar bem às colônias. Nós usamos um conjunto de dados fornecido no site do projeto OpenCFU: https://sourceforge.net/projects/opencfu/files/samples/plosPicHQ.zip/download, que é baseado em Staph. AU. em placas de ágar LB. Existem 19 imagens de alta qualidade neste conjunto de dados cada uma com uma resolução de 1538 × 1536. AutoCellSeg foi comparado com OpenCFU executando ambos no modo parcialmente automatizado (ver “seleção de processo” em dados suplementares 2).,

o conhecimento a priori para OpenCFU é baseado em trilha e erro e nenhuma visão geral do conjunto de dados completo está disponível. OpenCFU foi executado com o raio mínimo de 1 pixel (parâmetro global) para as colônias, uma vez que várias imagens têm colônias muito pequenas. A configuração do parâmetro para AutoCellSeg é indicada nos dados suplementares 5.os resultados de um dos pratos densamente povoados são apresentados na Fig. 5. OpenCFU faz um bom trabalho em encontrar quase todas as colônias em modo automatizado., A subestimação das colônias por AutoCellSeg neste caso foi causada pela exclusão das colônias nos limites da placa de petri no modo totalmente automatizado, sem correção. No entanto, a verdade do terreno não estava disponível a partir do link onde este conjunto de dados foi baixado. Portanto, era apenas razoável comparar os resultados de ambos os softwares uns com os outros. Se escolhermos um valor muito pequeno para menor raio em OpenCFU, o ruído fora do recipiente é detectado como mostrado na segunda imagem da segunda linha na Fig. 5., Aqui, AutoCellSeg tem uma vantagem porque a máscara de contêiner é extraída automaticamente e nada é detectado fora dela. Por outro lado, a AutoCellSeg pode deixar algumas colônias menores não detectadas, dependendo da seleção do usuário durante a fase de extração a priori. Mas este é raramente o caso e pode ser facilmente resolvido na etapa de correção.

No pós-processamento, apenas a remoção de falsos segmentos são possíveis em OpenCFU como indicado pela seta na segunda imagem da última linha na Fig. 5. Aí reside um problema evidente, que no caso de segmentos não detectados, um usuário não pode adicionar novos segmentos (ver primeira imagem na segunda linha da Fig. 5). A este respeito, a AutoCellSeg oferece plena flexibilidade adicionando segmentos indetectados e removendo segmentos falsamente detectados (ver terceira imagem na segunda e terceira filas de Fig. 5)., O objetivo aqui é comparar a contagem de colônias para todas as imagens por ambos os softwares, levando em conta o tamanho das colônias detectadas. A contagem final obtida de ambos os Softwares foi bastante comparável (ver dados suplementares 5).

Lima

AutoCellSeg: robusto automática de unidades formadoras de colónias (UFC)/célula de análise adaptativa de segmentação de imagens e de fácil utilização pós-técnicas de edição

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A aplicação a outro conjunto de dados

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