DISCUSSÃO
O presente estudo demonstrou a possibilidade de photodynamically inactivação de bactérias gram-positivas e bactérias gram-negativas após a incubação com 5-ALA (ácido ou MAL. O perfil característico da produção de porfirina induzida pela 5-ALA em função da concentração do substrato sublinha a forte relação entre estes dois parâmetros e a importância de determinar as concentrações eficazes óptimas de cada substrato., A curva em forma de sino observada está de acordo com as curvas obtidas em estudos de cultura celular de porfirinas derivadas de 5-ALA e 5-ALA (27).
sabe-se que, para além da PPIX, as porfirinas em geral podem inibir diferentes enzimas envolvidas no ciclo biossintético heme, a fim de evitar a acumulação de grandes quantidades de PAPs intracelulares (1). No entanto, este feedback negativo resultaria no aparecimento de um patamar em termos de produção total de porfirina com concentrações crescentes de 5-ALA e não pode explicar a curva em forma de sino., Os nossos resultados mostraram que, em concentrações acima da concentração óptima, o próprio 5-ALA parece ter um efeito inibitório na formação da porfirina, apesar de as concentrações de medicamentos tóxicos não terem sido atingidas. Além disso, as mesmas bactérias incubadas com MAL produziram quantidades significativamente maiores de PAPs do que o composto original, sugerindo que as capacidades máximas de produção de PAP não foram alcançadas.as diferenças nas concentrações óptimas observadas para 5-ALA e MAL podem resultar de diferentes mecanismos de absorção., É sabido que, nas células animais, o 5-ALA e o MAL são transportados para o citosol através de diferentes mecanismos de transporte activo (23); no entanto, mais derivados lipofílicos entram através da difusão passiva através das membranas ou endocitose. Em bactérias gram-negativas, a membrana dupla impede a penetração de moléculas exógenas, enquanto as porinas, que são canais transmembranares, permitem que apenas pequenas moléculas hidrofilicas, geralmente nutrientes, entrem na bactéria (18)., Assim, a entrada de 5-ALA em bactérias gram-negativas não é problemática (28), como demonstrado pela baixa concentração necessária para a indução óptima de PAP. No caso do MAL, a adição de uma cadeia de metilo no grupo carboxílico aumenta o coeficiente de partição óleo-água de logaritmo de -1,52 para -0,94 (27), que ainda é considerado hidrofílico. Assim, este composto também pode entrar no citosol bacteriano através de canais de porina., Contudo, as concentrações elevadas (3 a 10 mM) necessárias para induzir uma formação suficiente de PAP indicam que a penetração ou a disponibilidade podem variar em relação à do composto original.
O fato de que mais lipofílico de derivativos, tais como PAL, HAL, e OAL, não induzem qualquer significativas PAP formação, pode ser explicado pelo véu altamente lipofílico compostos em membranas bacterianas ou pelo fato de que o altamente anfifílica propriedades destes instrumentos pode induzir a ruptura de membrana, causando escuro toxicidade.,
vimos uma forte correlação entre a eficiência da PDI e a quantidade total de PAPs formados na E. coli K-12. No entanto, isto não pode ser extrapolado para outras estirpes devido aos diferentes tipos de porfirinas produzidas, mecanismos de proteção (12), e localização da porfirina. Todos os tipos de porfirinas observados em nosso estudo demonstraram a capacidade de absorver luz e gerar espécies reativas de oxigênio (22). A principal diferença entre estas porfirinas endógenas está relacionada com o número de grupos carboxílicos, que influenciam a solubilidade, lipofilicidade, agregação e localização., No caso da E. coli, verificou-se que o tipo de PAP depende da quantidade de porfirinas produzidas. Quando pequenas quantidades de porfirinas são sintetizadas, a maquinaria enzimática da bactéria foi capaz de proceder à descarboxilação de uma elevada proporção destas porfirinas, levando à acumulação principalmente de porfirinas lipofílicas. Quando grandes quantidades de PAP são produzidas, o processo enzimático pode ser esmagado, levando a uma maior proporção de porfirinas hidrofilicas. Esta tendência foi observada apenas nas estirpes de E. coli (dados não apresentados para as outras espécies)., Em contraste, S. aureus quase exclusivamente produziu UPs e foi eficientemente fotoinativado, enquanto P. aeruginosa produziu quatro a cinco vezes mais porfirinas, principalmente PPIX, mas não foi mais eficientemente fotoinativado.as duas condições principais necessárias são a acumulação de quantidades suficientes de PAPs nas bactérias visadas e a irradiação efectiva para activar a PS. De facto, quando se utiliza este tipo de PS pró-droga, a PDI conduzida em condições subóptimas pode conduzir a resultados contraditórios. Por exemplo, Karrer et al., (10) demonstraram que a IDP mediada por 5-ALA induziu uma inibição significativa do crescimento de S. aureus, mas não de Staphylococcus epidermidis. Em contraste, Nitzan et al. (19) observou-se que a IDP mediada pelo 5-ALA era eficaz tanto contra o S. aureus como contra o S. epidermidis, mas não contra estirpes gram-negativas, incluindo E. coli e P. aeruginosa. As duas últimas estirpes foram fotoinativadas com sucesso por Szocs et al. (24) and Lee et al. (14) após incubação com 5-ALA, respectivamente., Portanto, o presente estudo demonstra claramente não só que as concentrações devem ser otimizadas e adaptadas às bactérias específicas, mas também que a lipofilicidade do próprio precursor PAP deve ser otimizada. Embora o MAL e o BAL parecessem ser mais eficazes na inactivação da E. coli, o 5-ALA demonstrou ter a capacidade de inactivar eficazmente o S. aureus em concentrações elevadas., No presente estudo nós têm focado principalmente a PAP precursores que ganharam a aprovação da comercialização para administração tópica (5-ALA, do MAL, e HAL), dois compostos intermediários lipophilicity (BAL e PAL), e mais um composto lipofílico (OAL) que ainda era solúvel em água nas concentrações utilizadas no nosso estudo. No entanto, em estudos futuros devem ser considerados compostos mais moderadamente lipofílicos, tais como os ésteres etílico, propílico e benzílico.,no nosso estudo, tanto o 5-ALA como o MAL demonstraram induzir quantidades aumentadas de PAPs em todas as bactérias tratadas quando foram aplicadas as condições ideais. Na E. coli, o efeito inibitório total observado após incubação com MAL, embora tenha sido observado em concentrações mais elevadas do fármaco, foi até 2 ordens de magnitude mais elevado do que o obtido após incubação com 5-ALA. Contudo, esta vantagem não foi observada nas outras estirpes utilizadas no presente estudo., Na prática clínica, o MAL pode ter outras vantagens, especialmente no que diz respeito às suas propriedades farmacocinéticas e farmacodinâmicas, que foram estabelecidas em ensaios clínicos para o tratamento de carcinomas basocelulares e queratose actínica (6, 7, 17). Como o 5-ALA apresentou uma curva bifásica de inactivação, as concentrações intermédias resultaram na inactivação subóptima das bactérias visadas. Um comportamento mais desejável foi obtido com MAL, como a sobrevivência bacteriana continuamente diminuiu com o aumento das concentrações de MAL., Neste caso, a formação de PAP, e portanto, PDI, só foi inibida quando as concentrações de drogas tóxicas (superiores a 10 mM) foram atingidas.
não só a capacidade de induzir PAPs é importante, como os derivados 5-ALA, incluindo MAL, também podem ter já estabelecidas vantagens em relação à biodisponibilidade local após administração tópica para o tratamento de outras patologias. A administração tópica de MAL tem demonstrado resultar em uma distribuição mais seletiva e mais profunda de PAPs em pacientes com carcinomas basocelulares espessos (20)., Portanto, infecções mais profundas podem ser tratadas mais eficazmente com este composto. Em alguns casos, o MAL mostrou ser mais seletivo do que 5-ALA para tecidos doentes, como queratoses solares (6), levando potencialmente a menos danos colaterais no tecido saudável circundante. Além disso, demonstrou-se que o MAL tem uma absorção sistémica limitada e que induz menos dor durante a irradiação, o que é um parâmetro importante quando são necessárias múltiplas sessões de PDT (11).,
As concentrações mais eficazes utilizadas neste estudo podem parecer relativamente elevadas em comparação com as concentrações de outros compostos PS, que são utilizados em concentrações micromolares; na verdade, para alguns outros compostos PS, o tempo de aplicação é de minutos em vez de horas (25, 26). No entanto, a alta selectividade dos compostos que testamos, como demonstrado em outros domínios médicos, pode fornecer os meios para erradicar potencialmente infecções bacterianas sem prejudicar os tecidos circundantes saudáveis.,
O uso dos compostos testados em nossos estudos será limitado a infecções bacterianas que são acessíveis à administração local do medicamento e da luz, incluindo a pele, os pulmões, a cavidade oral, a área urogenital, e do trato gastrointestinal. Como exemplo, os ensaios clínicos iniciais demonstraram resultados promissores da PDI do Helicobacter pylori (30) mediada por 5-ALA. Os actuais desenvolvimentos nesta área centram-se no desenvolvimento de derivados sistemicamente aplicáveis do 5-ALA com semi-vidas prolongadas, o que contornará a necessidade de aplicar os compostos localmente., Além disso, a repetibilidade pode ser um activo importante da IDP, uma vez que a toxicidade cumulativa (21) e a resistência bacteriana induzida por tratamentos repetidos (13) não foram notificadas até à data.por conseguinte, quando se utilizaram concentrações óptimas, os derivados de cadeia curta de 5-ALA e 5-ALA (MAL e BAL) induziram níveis elevados de acumulação de PAP tanto nas estirpes bacterianas gram-positivas como gram-negativas que testámos, atingindo o primeiro pré-requisito para uma IDP bem sucedida., Em contraste, os derivados 5-ALA de cadeia longa (PAL, HAL e OAL) demonstraram toxicidades escuras elevadas que aumentaram com a lipofilicidade, e a indução com estes compostos não demonstrou formação significativa de PAP. Como a formação MAL de PAP induzida de forma eficiente em bactérias, pode mostrar uma melhor eficácia in vivo, especialmente devido às suas propriedades farmacocinéticas e farmacodinâmicas vantajosas. A sua capacidade para ser utilizada no tratamento de infecções locais deve ser investigada em experiências in vivo.