en este capítulo, se presentan los resultados de los nuevos datos de referencia que creamos y otros conjuntos de datos utilizados en trabajos anteriores. AutoCellSeg se comparó con otras herramientas de software utilizando varias medidas de calidad.,

nuevos datos de referencia

etiquetamos 12 imágenes, que fueron adquiridas en nuestros laboratorios, para la verdad de tierra de diferentes especies bacterianas (3 imágenes cada una) incluyendo E. coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus aureus. Las imágenes fueron etiquetadas delineando límites de colonias usando Adobe Photoshop y luego con MATLAB para crear imágenes binarias etiquetadas. En consecuencia, estas imágenes de la verdad de tierra se utilizan para extraer: (1) recuento de colonias (2) Tamaño de cada colonia individual en píxeles.,

los informes anteriores sobre la especificidad y sensibilidad de las herramientas utilizadas para el recuento de colonias se basan predominantemente en el recuento total solamente. Tal comparación da una menor idea de la plausibilidad de las colonias, especialmente en términos del tamaño detectado. El tamaño de cada colonia podría ser de igual importancia en muchos experimentos. Por lo tanto, también debe incorporarse un criterio de calidad basado en la precisión de la segmentación. La medida de calidad Q, basada en24, se utilizó para evaluar el resultado del proceso de segmentación (ver datos complementarios 1 para más detalles)., Q tiene en cuenta: la diferencia en el conteo de segmentos con respecto a la verdad de tierra (q1), y el número de píxeles de segmento mal clasificados (q2).

utilizando Q en el nuevo benchmark, se compararon diferentes herramientas(Ver Fig. 2). Dado que tanto IJM como ImageJ Edge fallan en presencia de un contenedor CFU en la imagen, optamos por soluciones alternativas como OpenCFU. También desarrollamos una tubería a medida en CellProfiler, basada en el trabajo realizado por8, y una combinación de Ilastik y CellProfiler para la comparación con AutoCellSeg., Mientras que AutoCellSeg extrae el área de la placa de Petri automáticamente, CellProfiler y OpenCFU no lo hacen. En OpenCFU se necesita una región de interés (ROI) en forma de un círculo de 3 puntos o polígono complejo para extraer la información que solo está presente dentro del contenedor. La función» Auto-Petri » mencionada en 12 no se ve en ninguna parte de su GUI y tampoco funciona perfectamente en el back-end ya que en varios resultados el ruido fuera del plato se segmentó. Se utilizó una canalización separada para cada especie y se puede encontrar en el repositorio AutoCellSeg: https://github.com/AngeloTorelli/AutoCellSeg/tree/master/DATA/Benchmark., Por ejemplo, la canalización de CellProfiler y los resultados para E. coli se pueden encontrar en su propia carpeta: https://github.com/AngeloTorelli/AutoCellSeg/tree/master/DATA/Benchmark/E. coli/CellProfiler. Debido al ajuste manual de los parámetros y la selección manual del plato perti, CellProfiler puede no ser la solución para un alto rendimiento y una segmentación completamente automatizada. El resultado de segmentación producido por CellProfiler es bueno para los conjuntos de datos de referencia, por lo tanto, se incluyó para la comparación.,

los Resultados de los métodos utilizados en el nuevo punto de referencia: CellProfiler (rojo), Ilastik + CellProfiler (cian), OpenCFU (azul) y AutoCellSeg (verde). Se selecciona una imagen de cada especie (indicada por el número de imagen en las esquinas de la imagen) para demostrar la comparación. Los gráficos muestran la segmentación / Conteo (Q en el eje y de la primera fila) y la desviación del conteo manual (q1 en el eje y de la segunda fila) para todos los métodos utilizados basados en el punto de Referencia Completo (en el eje x)., Q incorpora las medidas tanto para el tamaño como para el recuento de UFC.

La inclusión de Ilastik se realizó porque ofrece una predicción pixelwise razonable mediante el uso de aprendizaje automático supervisado. Para cada especie bacteriana, solo se tomó una imagen para etiquetar píxeles del fondo y colonias (problema de dos clases) utilizando todas las características disponibles hasta que la segmentación resultante estuvo cerca de la verdad del suelo. Los resultados de la segmentación se exportaron como archivos tiff y posteriormente se combinaron con la canalización CellProfiler para su cuantificación.,

OpenCFU evita falsas detecciones debido a sus cuidadosos criterios de selección de colonias. En OpenCFU el usuario tiene que tener cuidado con el rango de tamaño de Colonia para ser introducido manualmente usando la barra deslizante. Si se selecciona un radio inferior muy pequeño, OpenCFU produce muchos falsos positivos además de detectar el ruido tanto dentro como fuera del contenedor CFU. Por el contrario, si un radio más bajo se establece en un valor adecuado (es decir, 25-35 en el caso de Staphylococcus aureus), el recuento de colonias se subestima en gran medida., Un usuario primero tiene que probar diferentes valores para el radio inferior con el fin de obtener un buen resultado de segmentación. La selección de estos valores puede ser trivial para el usuario experto, pero incluso entonces todavía requiere ensayo y error si se van a evaluar diferentes conjuntos de datos con diferentes resoluciones. Este problema se rectifica adecuadamente en AutoCellSeg, donde el usuario solo tiene que hacer clic en una colonia pequeña y una grande, ya que el radio inferior y superior se extraen automáticamente utilizando el método de marcha rápida.

el otro problema principal en OpenCFU es que no hay una solución de procesamiento por lotes completamente automatizada., Un usuario tiene que hacer clic manualmente en la pestaña’ > ‘ en la GUI para procesar la siguiente imagen. Esto dificulta su capacidad para ser utilizado para conjuntos de datos más grandes, incluso cuando los parámetros globales para la segmentación/Conteo se pueden establecer de forma segura. Por el contrario, AutoCellSeg permite ser utilizado en un modo totalmente automatizado sin ningún tipo de intervención humana durante su proceso de ejecución.

tanto OpenCFU como AutoCellSeg se operaron en modo semiautomático (ver ‘selección de procesos’ en datos suplementarios 2 para diferentes modos de operación)., Los resultados de la segmentación se obtuvieron como máscaras binarias directamente de autocellseg y cellprofiler pipeline. Sin embargo, en el caso de OpenCFU, las características utilizables para la comparación de calidad requerida son el centro y el radio de las colonias. Este es otro inconveniente de OpenCFU, que uno no puede obtener una máscara binaria directamente para la comparación del recuento / tamaño de las colonias con la verdad de tierra. Usando el centro y el radio de las colonias, reconstruimos círculos binarios para emular las colonias y usamos la segmentación de cuencas para separar las colonias superpuestas., Esto se hizo para igualar el número y el tamaño de las colonias extraídas del software de OpenCFU. Las tres máscaras binarias obtenidas se compararon contra la verdad de tierra para el recuento total y el tamaño de las colonias utilizando Q.

algunos resultados de ejemplo del nuevo conjunto de datos de imagen de referencia se muestran en la Fig. 2. Los colores rojo, cian, azul y verde se utilizan para representar CellProfiler, Ilastik + CellProfiler, OpenCFU y AutoCellSeg respectivamente. En algunos casos, CellProfiler ofrece una muy buena segmentación., Los resultados de Ilastik con CellProfiler en operación por lotes no fueron drásticamente mejores que OpenCFU o CellProfiler. Sin embargo, la combinación de los dos produce resultados comparables a AutoCellSeg al etiquetar todas las imágenes individualmente, pero se produce a expensas del tiempo y el esfuerzo de etiquetado. AutoCellSeg todavía supera a las otras soluciones en términos de calidad Q del resultado de segmentación. La comparación individual se puede ver en los gráficos de la Fig. 2., La comparación global entre AutoCellSeg, OpenCFU y CellProfiler y la combinación de Ilastik + Cellprofiler se presenta en la tabla 1 utilizando un valor promedio Q (Q m ) y un valor promedio q1 (q1,m).

control / test analysis

a diferencia de otras soluciones de software de análisis CFU, AutoCellSeg tiene la posibilidad de comparar diferentes modos de datos., Por ejemplo, en un experimento microbiológico, uno puede necesitar conocer los cambios en la morfología y el número de UFC que ocurren durante el tratamiento. La prueba fue irradiar las colonias con luz azul para observar las diferencias en tamaño y recuento de colonias. Por lo tanto, AutoCellSeg solicita al usuario que seleccione Imágenes de control y prueba para hacer una comparación experimental. Por ejemplo, elegimos un conjunto de imágenes de control y prueba de E. coli. Se realiza una prueba (es decir, irradiación de luz) para observar el cambio de tamaño de la UFC con respecto a las imágenes de control.,

Hay tres pares de prueba/control representados por números. Las imágenes se cargan en AutoCellSeg y los parámetros se ajustan como se muestra en los datos suplementarios 3. El programa se ejecuta en modo semiautomático. La corrección se realiza en cada imagen individual y cuando se procesan todas las imágenes, el usuario puede elegir mostrar gráficos de comparación. Los contornos de segmento (la salida después de ejecutar el proceso) son los resultados de la detección de AutoCellSeg. Los resultados de segmentación para todas las imágenes se muestran en: https://github.com/AngeloTorelli/AutoCellSeg/tree/master/DATA/control_test., Los contornos cian representan la delineación de cfu de control y el rojo representa los contornos del experimento de prueba dependiendo de la Convención de nomenclatura. Para cada par de conjuntos de datos, se traza una función de estimación de densidad del núcleo (KDE) que representa la distribución de tamaño de las colonias (en píxeles) como se muestra en la Fig. 3. La función devuelve una estimación de densidad de probabilidad de tamaño CFU. La estimación se basa en una función normal del núcleo, y se evalúa en puntos igualmente espaciados, x i, que cubren el rango de los datos en x. aquí, x se usa para describir el tamaño de la UFC a.,

análisis de imágenes de control/prueba: la primera y segunda fila a la izquierda muestran los resultados de segmentación para imágenes de control (azul claro) y prueba (rojo) respectivamente. En el lado derecho, la gráfica de estimación de densidad del núcleo (kde) se muestra en el eje y para los tamaños de Colonia en píxeles (eje x). El ancho de banda (bw = 2000) aquí determina la suavidad en las curvas., Las líneas verdes en la gráfica representan los resultados del experimento de control, mientras que las líneas rojas representan los resultados del experimento de prueba (irradiación de luz en nuestro caso). El número de colonias encontradas en cada imagen se denota por n usando el color rojo/verde basado en el tipo de experimento (luz/control).

En el gráfico de la Fig. 3, la curva verde representa la distribución de tamaño en colonias de control y la curva discontinua roja muestra la distribución de tamaño de las UFC después de la irradiación de luz. La suavidad de la curva es controlada por un parámetro de ancho de banda bw., En este conjunto de datos, se utilizó bw = 2000. El uso de valores de bw más pequeños podría resultar en curvas menos suaves y probablemente más de un pico dependiendo de la varianza en el tamaño de las UFC. Los valores negativos al inicio del eje x se deben a la extrapolación de la función de suavizado en el lado izquierdo del pico en X-data. This does not indicate the existence of colonies with a negative CFU area.

también es posible ver el cambio en el área y el recuento de UFC después de los experimentos de prueba. En La Fig. 4, el gráfico de la izquierda muestra el cambio en las áreas de CFU después de la irradiación de luz., Las áreas de control están normalizadas a 1. Cada color se utiliza para representar un experimento diferente. En general, se observa que los tamaños de UFC disminuyen después de la irradiación de luz en este caso. El gráfico a la derecha de la Fig. 4 muestra el recuento absoluto de UFC tanto en condiciones de control como de prueba. Se puede ver que el recuento promedio en esta sesión de experimento ha disminuido. De manera similar, se pueden analizar diferentes imágenes de experimentos de control y prueba en AutoCellSeg.,

vista general gráficas de cambio en el recuento total y el tamaño de las UFC después de los experimentos de prueba. El gráfico de la izquierda muestra el cambio en el tamaño absoluto de las colonias (normalizado a 1 para cada par de control/prueba individual). Esto se muestra para expresar el cambio en el tamaño de cada par de experimentos. El valor medio de los tres experimentos se da como Media = 0.88. La gráfica de la derecha es el recuento absoluto de colonias detectadas en cada experimento., n Ctr = 48 y N Li = 40 muestran el recuento promedio de colonias para las imágenes de control y luz respectivamente. Los diferentes colores utilizados aquí son para mostrar diferentes pares (1:control/2: luz) de experimentos.

AutoCellSeg dibuja información a priori automáticamente de los ejemplos de entrada incluso si las colonias tienen una variación considerablemente alta en tamaño. Por lo tanto, AutoCellSeg se puede utilizar fácilmente para otros conjuntos de datos., Esto también puede funcionar para diferentes estructuras celulares, incluso cuando no son muy redondas, ya que AutoCellSeg tiene en cuenta la excentricidad de los objetos utilizando la entrada de conocimiento gráfico a priori. AutoCellSeg también extrae otras características a priori basadas en la intensidad, en caso de detección de falsos positivos. Un ejemplo de video del uso de AutoCellSeg para el análisis de pares de control/prueba se da en los datos suplementarios 4.

aplicación a otro conjunto de datos

AutoCellSeg se aplicó a otros conjuntos de datos de imágenes con colonias., Es razonable probar un conjunto de datos de imágenes bien segmentadas con un fondo y un primer plano diferentes para mostrar la robustez de AutoCellSeg. Además, también es imperativo demostrar el rendimiento de AutoCellSeg en diferentes modos de operación. También se mostró el rendimiento de AutoCellSeg en la segmentación de células de mamíferos fluorescentes y los datos de lotes y en imágenes seleccionadas al azar (ver datos suplementarios 5).,

fondo invertido

Un desafío sería utilizar un conjunto de datos que tenga un fondo claro con colonias más oscuras en primer plano para ver si el software puede adaptarse bien a las colonias. Utilizamos un conjunto de datos proporcionado en el sitio web del proyecto OpenCFU: https://sourceforge.net/projects/opencfu/files/samples/plosPicHQ.zip/download, que se basa en estafilococos. au. en placas de agar LB. Hay 19 imágenes de alta calidad en este conjunto de datos, cada una con una resolución de 1538 × 1536. AutoCellSeg se comparó con OpenCFU ejecutando ambos en modo parcialmente automatizado (ver ‘selección de procesos’ en datos suplementarios 2).,

el conocimiento a priori para OpenCFU se basa en el rastro y el error y no hay una visión general del conjunto de datos completo disponible. OpenCFU se ejecutó con un radio mínimo de 1 píxel (parámetro global) para las colonias ya que varias imágenes tienen colonias muy pequeñas. La configuración de parámetros para AutoCellSeg se indica en los datos complementarios 5.

los resultados de uno de los platos densamente poblados se muestran en la Fig. 5. OpenCFU hace un buen trabajo al encontrar casi todas las colonias en modo automatizado., La subestimación de las colonias por AutoCellSeg en este caso fue causada debido a la exclusión de las colonias en los límites de la placa de petri en el modo totalmente automatizado sin corrección. Sin embargo, la verdad sobre el terreno no estaba disponible en el enlace donde se descargó este conjunto de datos. Por lo tanto, era razonable comparar los resultados de ambos programas entre sí. Si elegimos un valor muy pequeño para el radio inferior en OpenCFU, el ruido fuera del contenedor se detecta como se muestra en la segunda imagen de la segunda fila en la Fig. 5., Aquí, AutoCellSeg tiene una ventaja porque la máscara de contenedor se extrae automáticamente y no se detecta nada fuera de ella. Por otro lado, AutoCellSeg puede dejar algunas colonias más pequeñas sin detectar dependiendo de la selección del usuario durante la fase de extracción a priori. Pero esto rara vez es el caso y se puede resolver fácilmente en el paso de corrección.

AutoCellSeg y OpenCFU resultados de segmentación de las imágenes con un fondo más claro y más oscuro colonias., Las cajas azules (imagen superior izquierda) muestran el resultado de detección de OpenCFU y la delineación Verde (imagen superior derecha) es para la segmentación AutoCellSeg. Ampliar las secciones de las áreas de imagen seleccionadas de las imágenes en la primera fila sin post-edición (segunda fila). Resultado después del paso de corrección (última fila). OpenCFU ha perdido un conglomerado de colonias (primera imagen, segunda fila). OpenCFU ha detectado algún ruido fuera del plato (segunda imagen, segunda fila). Segmentación AutoCellSeg de la misma sección que en la primera imagen de la segunda fila (tercera imagen, segunda fila)., En AutoCellSeg, algunas colonias en el borde del plato permanecen sin ser detectadas (última imagen, segunda fila). Segmento erróneo detectado fuera podría ser eliminado en OpenCFU (segunda imagen, última fila). Los segmentos no detectados se pueden hacer clic interactivamente en AutoCellSeg (tercera imagen, última fila). Basado en el punto de semilla definido por el usuario, la colonia no detectada se segmenta utilizando el método de marcha rápida (última imagen, última fila).,

en el post-procesamiento, solo la eliminación de segmentos falsos son posibles en OpenCFU como se indica por la flecha en la segunda imagen de la última fila en la Fig. 5. Ahí radica un problema evidente, que en el caso de segmentos no detectados, un usuario no puede agregar nuevos segmentos (vea la primera imagen en la segunda fila de la Fig. 5). En este sentido, AutoCellSeg ofrece una flexibilidad total al agregar segmentos no detectados y eliminar los detectados falsamente (ver tercera imagen en la segunda y tercera fila de la Fig. 5)., El objetivo aquí es comparar el recuento de colonias para todas las imágenes de ambos programas teniendo en cuenta el tamaño de las colonias detectadas. El recuento final obtenido de ambos programas fue bastante comparable (ver datos suplementarios 5).