dans ce chapitre, les résultats des nouvelles données de référence que nous avons créées et d’autres ensembles de données utilisés dans les travaux précédents sont présentés. AutoCellSeg a été comparé à d’autres outils logiciels en utilisant diverses mesures de qualité.,

nouvelles données de référence

Nous avons étiqueté 12 images, qui ont été acquises dans nos laboratoires, pour la vérité au sol de différentes espèces bactériennes (3 images chacune), y compris E. coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa et Staphylococcus aureus. Les images ont été étiquetées en délimitant les limites des colonies à L’aide D’Adobe Photoshop, puis avec MATLAB pour créer des images binaires étiquetées. Par conséquent, ces images de vérité au sol sont utilisées pour extraire: (1) le nombre de colonies (2) La Taille de chaque colonie individuelle en pixels.,

Les rapports précédents sur la spécificité et la sensibilité des outils utilisés pour le comptage des colonies sont principalement basés sur le dénombrement total seulement. Une telle comparaison donne un aperçu moindre de la plausibilité des colonies, en particulier en termes de taille détectée. La taille de chaque colonie pourrait être d’une importance égale dans de nombreuses expériences. Par conséquent, un critère de qualité basé sur la précision de segmentation devrait également être incorporé. La mesure de la qualité Q, basée sur24, a été utilisée pour évaluer le résultat du processus de segmentation (voir les données supplémentaires 1 pour plus de détails)., Q prend en compte: la différence dans le nombre de segments par rapport à la vérité au sol (q1) et le nombre de pixels de segments mal classés (q2).

en utilisant Q sur un nouveau benchmark, différents outils ont été comparés (voir Fig. 2). Étant donné que IJM et ImageJ Edge échouent en présence d’un conteneur CFU dans l’image, nous avons opté pour des solutions alternatives comme OpenCFU. Nous avons également développé un pipeline sur mesure dans CellProfiler, basé sur le travail effectué par8, et une combinaison D’Ilastik et CellProfiler pour comparaison avec AutoCellSeg., Alors Qu’AutoCellSeg extrait automatiquement la zone de la boîte de Pétri, CellProfiler et OpenCFU ne le font pas. Dans OpenCFU, une région d’intérêt (ROI) sous la forme d’un cercle à 3 points ou d’un polygone complexe est nécessaire pour extraire les informations uniquement présentes à l’intérieur du conteneur. La fonction” Auto-Petri  » mentionnée dans12 n’est nulle part visible sur son interface graphique et elle ne fonctionne pas parfaitement au back-end car, dans plusieurs résultats, le bruit extérieur de la parabole était segmenté. Un pipeline séparé a été utilisé pour chaque espèce et se trouve dans le référentiel AutoCellSeg: https://github.com/AngeloTorelli/AutoCellSeg/tree/master/DATA/Benchmark., Par exemple, le pipeline CellProfiler et les résultats pour E. coli peuvent être trouvés dans son propre dossier: https://github.com/AngeloTorelli/AutoCellSeg/tree/master/DATA/Benchmark/E. coli/CellProfiler. En raison du réglage manuel des paramètres et de la sélection manuelle du perti dish, CellProfiler peut ne pas être la solution pour un débit élevé et une segmentation entièrement automatisée. Le résultat de segmentation produit par CellProfiler est bon pour les ensembles de données de référence, il a donc été inclus pour la comparaison.,

les Résultats de la méthode utilisée sur le nouvel indice de référence: CellProfiler (rouge), Ilastik + CellProfiler (cyan), OpenCFU (en bleu) et AutoCellSeg (vert). Une image de chaque espèce est sélectionnée (indiquée par le numéro d’image sur les coins de l’image) pour démontrer la comparaison. Les graphiques montrent la segmentation / comptage (Q sur l’axe y de la première ligne) et l’écart par rapport au comptage manuel (q1 sur l’axe y de la deuxième ligne) pour toutes les méthodes utilisées sur la base du benchmark complet (sur l’axe x)., Q incorpore les mesures pour la taille et le nombre d’UFC.

l’inclusion D’Ilastik a été faite parce qu’elle fournit une prédiction pixelwise raisonnable en utilisant l’apprentissage automatique supervisé. Pour chaque espèce bactérienne, une seule image a été prise pour marquer les pixels de l’arrière-plan et des colonies (problème à deux classes) en utilisant toutes les fonctionnalités disponibles jusqu’à ce que la segmentation résultante soit proche de la vérité au sol. Les résultats de segmentation ont été exportés sous forme de fichiers tiff et ensuite combinés avec le pipeline CellProfiler pour la quantification.,

OpenCFU évite les fausses détections grâce à ses critères de sélection rigoureux des colonies. Dans OpenCFU, L’utilisateur doit faire attention à la plage de taille de colonie à saisir manuellement à l’aide de la barre de défilement. Si un très petit rayon inférieur est sélectionné, OpenCFU produit beaucoup de faux positifs en plus de détecter le bruit à l’intérieur et à l’extérieur du conteneur UFC. Inversement, si un rayon inférieur est réglé sur une valeur appropriée (c’est-à-dire 25-35 dans le cas de Staphylococcus aureus), le nombre de colonies est largement sous-estimé., Un utilisateur doit d’abord essayer différentes valeurs pour un rayon inférieur afin d’obtenir un bon résultat de segmentation. La sélection de ces valeurs peut être triviale pour l’utilisateur expert, mais même dans ce cas, elle nécessite toujours des essais et des erreurs si différents ensembles de données avec des résolutions variables doivent être évalués. Ce problème est correctement corrigé dans AutoCellSeg, où l’utilisateur n’a qu’à cliquer sur une petite et une grande colonie car le rayon inférieur et le rayon supérieur sont ensuite extraits automatiquement à l’aide de la méthode de marche rapide.

L’autre problème principal dans OpenCFU est qu’il n’y a pas de solution de débit par lots entièrement automatisée., Un utilisateur doit cliquer manuellement sur l’onglet’> ‘ sur L’interface graphique pour traiter l’image suivante. Cela entrave sa capacité à être utilisée pour des ensembles de données plus importants, même lorsque les paramètres globaux de segmentation/comptage peuvent être définis en toute sécurité. Inversement, AutoCellSeg permet d’être utilisé en mode entièrement automatisé sans aucune intervention humaine pendant son processus de fonctionnement.

OpenCFU et AutoCellSeg fonctionnaient en mode semi-automatique (voir « sélection de processus » dans les données supplémentaires 2 pour les différents modes de fonctionnement)., Les résultats de la segmentation ont été obtenus sous forme de masques binaires directement à partir du pipeline AutoCellSeg et CellProfiler. Cependant, dans le cas D’OpenCFU, les caractéristiques utilisables pour la comparaison de qualité requise sont le centre et le rayon des colonies. C’est un autre inconvénient D’OpenCFU, que l’on ne peut pas obtenir un masque binaire directement pour comparer le nombre/taille des colonies avec la vérité au sol. En utilisant le centre et le rayon des colonies, nous avons reconstruit des cercles binaires pour imiter les colonies et utilisé la segmentation des bassins versants pour séparer les colonies qui se chevauchent., Cela a été fait pour correspondre au nombre et à la taille des colonies extraites du logiciel OpenCFU. Les trois masques binaires obtenus ont été comparés à la vérité au sol pour le nombre total et la taille des colonies en utilisant Q.

quelques exemples de résultats du nouvel ensemble de données d’image de référence sont illustrés à la Fig. 2. Les couleurs rouge, cyan, bleu et vert sont utilisées pour représenter CellProfiler, Ilastik + CellProfiler, OpenCFU et AutoCellSeg respectivement. Dans certains cas, CellProfiler offre une très bonne segmentation., Les résultats d’Ilastik avec CellProfiler en opération par lots n’étaient pas radicalement meilleurs Qu’OpenCFU ou CellProfiler. Néanmoins, la combinaison des deux produit des résultats comparables à AutoCellSeg lors de l’étiquetage de toutes les images individuellement, mais cela se fait au détriment du temps et de l’effort d’étiquetage. AutoCellSeg surpasse encore les autres solutions en termes de qualité Q du résultat de segmentation. La comparaison individuelle peut être vue dans les graphiques de la Fig. 2., La comparaison globale entre AutoCellSeg, OpenCFU et CellProfiler et la combinaison de Ilastik + Cellprofiler est donnée dans le tableau 1 en utilisant une valeur Q moyenne (Q m) et une valeur Q1 moyenne (q1,m).

analyse de contrôle/test

Contrairement aux autres solutions logicielles D’analyse CFU, AutoCellSeg a la possibilité de comparer différents modes de données., Par exemple, dans une expérience microbiologique, il peut être nécessaire de connaître les changements dans la morphologie et le nombre D’UFC qui se produisent pendant le traitement. Le test consistait à irradier les colonies avec de la lumière bleue pour observer les différences de taille et de nombre de colonies. Par conséquent, AutoCellSeg invite l’utilisateur à sélectionner des images de contrôle et de test afin de faire une comparaison par expérience. Par exemple, nous avons choisi un ensemble d’images de contrôle et de test d’E. coli. Un essai (c’est-à-dire l’irradiation de la lumière) est effectué pour observer le changement de taille de L’UFC par rapport aux images de contrôle.,

Il existe trois paires test/contrôle représentées par des nombres. Les images sont chargées dans AutoCellSeg et les paramètres sont ajustés comme indiqué dans les données supplémentaires 3. Le programme est ensuite exécuté en mode semi-automatique. La correction est effectuée sur chaque image individuelle et lorsque toutes les images sont traitées, l’utilisateur peut choisir d’Afficher des diagrammes de comparaison. Les contours de segment (la sortie après l’exécution du processus) sont les résultats de la détection AutoCellSeg. Les résultats de segmentation pour toutes les images sont affichés dans: https://github.com/AngeloTorelli/AutoCellSeg/tree/master/DATA/control_test., Les contours Cyan représentent la délimitation CFU de contrôle et le rouge représente les contours de l’expérience de test en fonction de la convention de dénomination. Pour chaque paire d’ensemble de données, une fonction Kernel Density Estimation (KDE) est tracée représentant la distribution de taille des colonies (en pixels) comme indiqué sur la Fig. 3. La fonction renvoie une estimation de densité de probabilité de la taille de L’UFC. L’estimation est basée sur une fonction normale du noyau, et est évaluée à des points équitablement espacés, x i, qui couvrent la plage des données dans X. ici, x est utilisé pour décrire la taille de L’UFC A.,

analyse des images de contrôle / test: la première et la deuxième rangée à gauche montrent les résultats de segmentation pour les images de contrôle (bleu clair) et de test (rouge) respectivement. Sur le côté droit, le graphique Kernel Density Estimation (KDE) est affiché sur l’axe y pour les tailles de colonies en pixels (axe x). La bande passante (bw = 2000) détermine ici la douceur des courbes., Les lignes vertes dans le graphique représentent les résultats de l’expérience de contrôle, alors que les lignes rouges représentent les résultats de l’expérience de test (irradiation de la lumière dans notre cas). Le nombre de colonies trouvées dans chaque image est indiqué par n en utilisant la couleur rouge/verte en fonction du type d’expérience (lumière/contrôle).

Dans le graphique de la Fig. 3, la courbe verte représente la distribution de taille dans les colonies de contrôle et la courbe pointillée rouge montre la distribution de taille des UFC après irradiation de la lumière. La douceur de la courbe est contrôlée par un paramètre de largeur de bande bw., Dans cet ensemble de données, nous avons utilisé bw = 2000. L’utilisation de valeurs bw plus petites pourrait entraîner des courbes moins lisses et probablement plus d’un pic en fonction de la variance de la taille des UFC. Les valeurs négatives au début de l’axe x sont dues à l’extrapolation de la fonction de lissage sur le côté gauche du pic dans les données X. Cela n’indique pas l’existence de colonies avec une zone CFU négative.

Il est également possible de voir le changement de surface et le nombre d’UFC après les expériences de test. Dans La Fig. 4, le graphique sur la gauche montre le changement dans les zones UFC après l’irradiation de la lumière., Les zones de contrôle sont normalisées à 1. Chaque couleur est utilisée pour représenter une expérience différente. Dans l’ensemble, les tailles D’UFC diminuent après irradiation de la lumière dans ce cas. Le graphique à droite de la Fig. 4 indique le nombre absolu D’UFC dans les conditions de contrôle et d’essai. On peut voir que le nombre moyen dans cette session d’expérience a diminué. De la même manière, différentes images d’expériences de contrôle et de test peuvent être analysées dans AutoCellSeg.,

vue d’ensemble des parcelles de changement dans le nombre total et la taille de l’Ufc après test des expériences. Le graphique de gauche montre l’évolution de la taille absolue des colonies (normalisée à 1 pour chaque paire témoin/test individuelle). Ceci est montré pour exprimer le changement de taille pour chaque paire d’expériences. La valeur moyenne des trois expériences est donnée comme MeanVal = 0.88. Le graphique de droite est le nombre absolu de colonies détectées dans chaque expérience., n Ctr = 48 et n Li = 40 montrent le nombre moyen de colonies pour les images de contrôle et de lumière respectivement. Les différentes couleurs utilisées ici sont pour montrer différentes paires (1:contrôle/2: lumière) d’expériences.

AutoCellSeg tire automatiquement des informations a priori à partir des exemples d’entrée même si les colonies ont une variation de taille considérablement élevée. Par conséquent, AutoCellSeg peut facilement être utilisé pour d’autres ensembles de données., Cela peut également fonctionner pour différentes structures cellulaires, même lorsqu’elles ne sont pas très rondes, car AutoCellSeg prend en compte l’excentricité des objets en utilisant une entrée de connaissances a priori graphique. AutoCellSeg extrait également d’autres caractéristiques a priori basées sur l’intensité, en cas de détection de faux positifs. Un exemple vidéo d’utilisation D’AutoCellSeg pour l’analyse des paires contrôle / test est donné dans les données supplémentaires 4.

application à d’autres ensembles de données

AutoCellSeg a été appliqué à d’autres ensembles de données d’image avec des colonies., Il est raisonnable d’essayer un ensemble de données d’images bien segmentées avec un arrière-plan et un premier plan différents afin de montrer la robustesse D’AutoCellSeg. De plus, il est également impératif de démontrer les performances D’AutoCellSeg dans différents modes de fonctionnement. La performance D’AutoCellSeg sur la segmentation de cellules de mammifères fluorescents et les données par lots et sur des images sélectionnées au hasard a également été montrée (voir Données supplémentaires 5).,

arrière-plan inversé

un défi serait d’utiliser un ensemble de données ayant un arrière-plan clair avec des colonies plus sombres au premier plan pour voir si le logiciel peut bien s’adapter aux colonies. Nous avons utilisé un ensemble de données fourni sur le site Web du projet OpenCFU: https://sourceforge.net/projects/opencfu/files/samples/plosPicHQ.zip/download, qui est basé sur Staph. de l’ua. sur des plaques de gélose LB. Il y a 19 images de haute qualité dans cet ensemble de données avec chacune une résolution de 1538 × 1536. AutoCellSeg a été comparé à OpenCFU en exécutant les deux en mode partiellement automatisé (voir « sélection de processus » dans Données supplémentaires 2).,

Les connaissances a priori pour OpenCFU sont basées sur la trace et l’erreur et aucun aperçu de l’ensemble de données complet n’est disponible. OpenCFU a été exécuté avec le rayon minimum de 1 pixel (paramètre global) pour les colonies car plusieurs images ont de très petites colonies. Les paramètres pour AutoCellSeg sont donnés dans les données supplémentaires 5.

les résultats pour l’un des plats densément peuplés sont présentés à la Fig. 5. OpenCFU fait un bon travail pour trouver presque toutes les colonies en mode automatisé., La sous-estimation des colonies par AutoCellSeg dans ce cas a été causée par l’exclusion des colonies aux limites de la boîte de Pétri en mode entièrement automatisé sans correction. Cependant, la vérité au sol n’était pas disponible à partir du lien où cet ensemble de données a été téléchargé. Par conséquent, il était raisonnable de comparer les résultats des deux logiciels entre eux. Si nous choisissons une très petite valeur pour un rayon inférieur dans OpenCFU, le bruit à l’extérieur du conteneur est détecté comme indiqué dans la deuxième image de la deuxième rangée de la Fig. 5., Ici, AutoCellSeg a un avantage car le masque de conteneur est extrait automatiquement et rien n’est détecté en dehors de celui-ci. D’autre part, AutoCellSeg peut laisser certaines colonies plus petites non détectées en fonction de la sélection de l’utilisateur pendant la phase d’extraction a priori. Mais c’est rarement le cas et peut facilement être résolu dans l’étape de correction.

résultats de segmentation AutoCellSeg et OpenCFU pour les images avec un arrière-plan plus clair et des colonies plus sombres., Les boîtes bleues (image en haut à gauche) montrent le résultat de détection D’OpenCFU et la délimitation verte (image en haut à droite) est pour la segmentation AutoCellSeg. Zoom dans les sections des zones d’image sélectionnées des images de la première ligne sans post-édition (deuxième ligne). Résultat après l’étape de correction (dernière ligne). OpenCFU a manqué un conglomérat de colonies (première image, deuxième rangée). OpenCFU a détecté du bruit à l’extérieur de la parabole (deuxième image, deuxième rangée). Segmentation AutoCellSeg de la même section que dans la première image de la deuxième ligne (troisième image, deuxième ligne)., Dans AutoCellSeg, certaines colonies à la frontière du plat restent non détectées (dernière image, deuxième rangée). Le segment erroné détecté à l’extérieur peut être supprimé dans OpenCFU (deuxième image, dernière ligne). Les segments non détectés peuvent être cliqués de manière interactive dans AutoCellSeg (troisième image, dernière ligne). Sur la base du point de départ défini par l’utilisateur, la colonie non détectée est segmentée à l’aide de la méthode de marche rapide (dernière image, dernière ligne).,

Dans le post-traitement, seul le retrait de faux segments sont possibles dans OpenCFU comme indiqué par la flèche dans la deuxième image de la dernière ligne de la Fig. 5. Là se trouve un problème flagrant, que dans le cas de segments non détectés, un utilisateur ne peut pas ajouter de nouveaux segments (voir la première image dans la deuxième rangée de la Fig. 5). À cet égard, AutoCellSeg offre une flexibilité totale en ajoutant des segments non détectés et en supprimant des segments faussement détectés (voir troisième image dans les deuxième et troisième rangées de la Fig. 5)., L’objectif ici est de comparer le nombre de colonies pour toutes les images par les deux logiciels en tenant compte de la taille des colonies détectées. Le décompte final obtenu à partir des deux logiciels était assez comparable (voir Données supplémentaires 5).