In questo capitolo vengono presentati i risultati dei nuovi dati di riferimento che abbiamo creato e di altri set di dati utilizzati nei lavori precedenti. AutoCellSeg è stato confrontato con altri strumenti software utilizzando varie misure di qualità.,

Nuovi dati di riferimento

Abbiamo etichettato 12 immagini, che sono state acquisite nei nostri laboratori, per la verità a terra da diverse specie batteriche (3 immagini ciascuna) tra cui E. coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus. Le immagini sono state etichettate delineando i confini delle colonie utilizzando Adobe Photoshop e quindi con MATLAB per creare immagini binarie etichettate. Di conseguenza queste immagini di verità a terra vengono utilizzate per estrarre: (1) numero di colonie (2) dimensione di ogni singola colonia in pixel.,

I precedenti rapporti sulla specificità e la sensibilità degli strumenti utilizzati per il conteggio delle colonie si basano prevalentemente sul conteggio totale. Tale confronto fornisce una visione minore della plausibilità delle colonie, specialmente in termini di dimensioni rilevate. La dimensione di ogni colonia potrebbe essere di uguale importanza in molti esperimenti. Pertanto, dovrebbe essere incorporato anche un criterio di qualità basato sulla precisione della segmentazione. La misura di qualità Q, basata su24, è stata utilizzata per valutare l’esito del processo di segmentazione (vedere i dati supplementari 1 per maggiori dettagli)., Q tiene conto di: differenza nel conteggio dei segmenti rispetto alla verità di massa (q1) e numero di pixel di segmento classificati in modo errato (q2).

Utilizzando Q sul nuovo benchmark, sono stati confrontati diversi strumenti (vedi Fig. 2). Poiché sia IJM che ImageJ Edge falliscono in presenza di contenitore CFU nell’immagine, abbiamo optato per soluzioni alternative come OpenCFU. Abbiamo anche sviluppato una pipeline su misura in CellProfiler, basata sul lavoro svolto da8, e una combinazione di Ilastik e CellProfiler per il confronto con AutoCellSeg., Mentre AutoCellSeg estrae automaticamente l’area della capsula di Petri, CellProfiler e OpenCFU no. In OpenCFU è necessaria una regione di interesse (ROI) sotto forma di un cerchio a 3 punti o di un poligono complesso per estrarre le informazioni presenti solo all’interno del contenitore. La funzione “Auto-Petri” menzionata in12 non si vede da nessuna parte sulla sua GUI e non funziona perfettamente nel back-end poiché in diversi risultati il rumore al di fuori del piatto è stato segmentato. Una pipeline separata è stata utilizzata per ogni specie e può essere trovata nel repository AutoCellSeg: https://github.com/AngeloTorelli/AutoCellSeg/tree/master/DATA/Benchmark., Ad esempio, la pipeline CellProfiler e i risultati per E. coli possono essere trovati nella propria cartella: https://github.com/AngeloTorelli/AutoCellSeg/tree/master/DATA/Benchmark/E. coli/CellProfiler. A causa della regolazione manuale dei parametri e della selezione manuale del piatto perti, CellProfiler potrebbe non essere la soluzione per un throughput elevato e una segmentazione completamente automatizzata. Il risultato di segmentazione prodotto da CellProfiler è buono per i set di dati di benchmark, è stato quindi incluso per il confronto.,

i Risultati dei metodi utilizzati sul nuovo punto di riferimento: CellProfiler (rosso), Ilastik + CellProfiler (ciano), OpenCFU (blu) e AutoCellSeg (verde). Viene selezionata un’immagine di ogni specie (indicata dal numero dell’immagine sugli angoli dell’immagine) per dimostrare il confronto. I grafici mostrano segmentazione / conteggio (Q sull’asse y della prima riga) e deviazione dal conteggio manuale (q1 sull’asse y della seconda riga) per tutti i metodi utilizzati in base al benchmark completo (sull’asse x)., Q incorpora le misure sia per la dimensione che per il numero di CFU.

L’inclusione di Ilastik è stata fatta perché fornisce una ragionevole previsione pixelwise utilizzando l’apprendimento automatico supervisionato. Per ogni specie batterica, è stata scattata una sola immagine per etichettare i pixel dello sfondo e le colonie (problema di due classi) utilizzando tutte le funzionalità disponibili fino a quando la segmentazione risultante non è stata vicina alla verità del terreno. I risultati della segmentazione sono stati esportati come file tiff e successivamente combinati con la pipeline CellProfiler per la quantificazione.,

OpenCFU evita falsi rilevamenti grazie ai suoi accurati criteri di selezione delle colonie. In OpenCFU l’utente deve fare attenzione all’intervallo di dimensioni della colonia da inserire manualmente utilizzando la barra di scorrimento. Se viene selezionato un raggio inferiore molto piccolo, OpenCFU produce molti falsi positivi oltre a rilevare il rumore sia all’interno che all’esterno del contenitore CFU. Al contrario, se un raggio inferiore è impostato su un valore adatto (cioè 25-35 in caso di Staphylococcus aureus), il conteggio delle colonie è ampiamente sottostimato., Un utente deve prima provare valori diversi per raggio inferiore per ottenere un buon risultato di segmentazione. La selezione di questi valori può essere banale per l’utente esperto, ma anche in questo caso richiede ancora tentativi ed errori se devono essere valutati diversi set di dati con risoluzioni diverse. Questo problema viene adeguatamente corretto in AutoCellSeg, dove l’utente deve solo fare clic su una piccola e una grande colonia poiché il raggio inferiore e superiore vengono quindi estratti automaticamente utilizzando il metodo di marcia veloce.

L’altro problema principale in OpenCFU è che non esiste una soluzione di throughput batch completamente automatizzata., Un utente deve fare clic manualmente sulla scheda’> ‘ sulla GUI per elaborare l’immagine successiva. Ciò ostacola la sua capacità di essere utilizzato per set di dati più grandi anche quando i parametri globali per la segmentazione/conteggio potrebbero essere impostati in modo sicuro. Al contrario, AutoCellSeg consente di essere utilizzato in modalità completamente automatizzata senza alcun tipo di intervento umano durante il suo processo di esecuzione.

Sia OpenCFU che AutoCellSeg sono stati utilizzati in modalità semiautomatica (vedere ‘Selezione del processo’ in Dati supplementari 2 per le diverse modalità di funzionamento)., I risultati della segmentazione sono stati ottenuti come maschere binarie direttamente dalla pipeline AutoCellSeg e CellProfiler. Tuttavia, nel caso di OpenCFU, le caratteristiche utilizzabili per il confronto della qualità richiesta sono il centro e il raggio delle colonie. Questo un altro inconveniente di OpenCFU, che non si può ottenere direttamente una maschera binaria per confronto di conteggio / dimensione di colonie con verità di terra. Usando il centro e il raggio delle colonie, abbiamo ricostruito i cerchi binari per emulare le colonie e abbiamo usato la segmentazione dello spartiacque per separare le colonie sovrapposte., Questo è stato fatto per abbinare il numero e la dimensione delle colonie come estratto dal software OpenCFU. Tutte e tre le maschere binarie ottenute sono state confrontate con la verità di terra per il conteggio totale e la dimensione delle colonie usando Q.

Alcuni risultati di esempio del nuovo set di dati di immagine di benchmark sono mostrati in Fig. 2. I colori rosso, ciano, blu e verde sono utilizzati per rappresentare rispettivamente CellProfiler, Ilastik + CellProfiler, OpenCFU e AutoCellSeg. In alcuni casi, CellProfiler offre un’ottima segmentazione., I risultati di Ilastik con CellProfiler nell’operazione batch non erano drasticamente migliori di OpenCFU o CellProfiler. Tuttavia, la combinazione dei due produce risultati paragonabili a AutoCellSeg quando si etichettano tutte le immagini singolarmente, ma si tratta a scapito sia del tempo che dello sforzo di etichettatura. AutoCellSeg supera ancora le altre soluzioni in termini di qualità Q del risultato di segmentazione. Il confronto individuale può essere visto nei grafici di Fig. 2., Il confronto complessivo tra AutoCellSeg, OpenCFU e CellProfiler e la combinazione di Ilastik + Cellprofiler è riportato nella Tabella 1 utilizzando un valore medio Q (Q m) e un valore medio q1 (q1,m).

Control/test analysis

A differenza di altre soluzioni software di analisi CFU, AutoCellSeg ha la possibilità di confrontare diverse modalità di dati., Ad esempio, in un esperimento microbiologico, potrebbe essere necessario conoscere i cambiamenti nella morfologia e nel numero di CFU che si verificano durante il trattamento. Il test è stato quello di irradiare le colonie con luce blu per osservare le differenze di dimensioni e numero di colonie. Pertanto, AutoCellSeg richiede all’utente di selezionare controllare e testare le immagini al fine di effettuare un confronto esperimento-saggio. Ad esempio, abbiamo scelto una serie di immagini di controllo e test da E. coli. Un test (cioè irradiazione di luce) viene eseguito per osservare il cambiamento di dimensione CFU rispetto alle immagini di controllo.,

Ci sono tre coppie di test/controllo rappresentate da numeri. Le immagini vengono caricate in AutoCellSeg e i parametri vengono regolati come mostrato nei dati supplementari 3. Il programma viene quindi eseguito in modalità semi-automatica. La correzione viene eseguita su ogni singola immagine e quando tutte le immagini vengono elaborate, l’utente può scegliere di visualizzare i grafici di confronto. I contorni del segmento (l’output dopo l’esecuzione del processo) sono i risultati del rilevamento AutoCellSeg. I risultati di segmentazione per tutte le immagini sono mostrati in: https://github.com/AngeloTorelli/AutoCellSeg/tree/master/DATA/control_test., I contorni ciano rappresentano la delineazione del CFU di controllo e il rosso rappresenta i contorni dell’esperimento di prova in base alla convenzione di denominazione. Per ogni coppia di set di dati, viene tracciata una funzione di stima della densità del kernel (KDE) che descrive la distribuzione dimensionale delle colonie (in pixel) come mostrato in Fig. 3. La funzione restituisce una stima della densità di probabilità di dimensione CFU. La stima si basa su una normale funzione del kernel e viene valutata in punti equidistanti, x i, che coprono l’intervallo dei dati in x. Qui, x è usato per descrivere la dimensione CFU a.,

Analisi delle immagini di controllo / test: la prima e la seconda riga a sinistra mostrano rispettivamente i risultati della segmentazione per le immagini di controllo (blu chiaro) e di test (rosso). Sul lato destro, il grafico KDE (Kernel Density Estimation) viene visualizzato sull’asse y per le dimensioni delle colonie in pixel (asse x). La larghezza di banda (bw = 2000) qui determina la scorrevolezza nelle curve., Le linee verdi nella trama rappresentano i risultati dell’esperimento di controllo, dove le linee rosse rappresentano i risultati dell’esperimento di prova (irradiazione di luce nel nostro caso). Il numero di colonie trovate in ogni immagine è indicato da n usando il colore rosso/verde in base al tipo di esperimento (luce/controllo).

Nel grafico di Fig. 3, la curva verde descrive la distribuzione delle dimensioni nelle colonie di controllo e la curva tratteggiata rossa mostra la distribuzione delle dimensioni dei CFU dopo l’irradiazione della luce. La scorrevolezza della curva è controllata da un parametro di larghezza di banda bw., In questo set di dati, abbiamo usato bw = 2000. L’utilizzo di valori bw più piccoli potrebbe comportare curve meno uniformi e probabilmente più picchi a seconda della varianza delle dimensioni delle CFU. I valori negativi all’inizio dell’asse x sono dovuti all’estrapolazione della funzione smoothing sul lato sinistro del picco in x-data. Questo non indica l’esistenza di colonie con un’area CFU negativa.

È anche possibile vedere il cambiamento nell’area e nel conteggio delle CFU dopo gli esperimenti di prova. In Fig. 4, il grafico a sinistra mostra il cambiamento nelle aree CFU dopo l’irradiazione di luce., Le aree di controllo sono normalizzate a 1. Ogni colore viene utilizzato per rappresentare un esperimento diverso. Nel complesso, le dimensioni CFU sono viste diminuire dopo l’irradiazione di luce in questo caso. Il grafico a destra della Fig. 4 mostra il conteggio assoluto di CFU sia in condizioni di controllo che di prova. Si può vedere che il conteggio medio in questa sessione di esperimento è diminuito. In modo simile, immagini diverse da esperimenti di controllo e test possono essere analizzate in AutoCellSeg.,

Panoramica diagrammi di variazione del conteggio totale e delle dimensioni delle CFU dopo gli esperimenti di prova. Il grafico a sinistra mostra il cambiamento delle dimensioni assolute delle colonie (normalizzato a 1 per ogni singola coppia di controllo / test). Questo è mostrato per esprimere il cambiamento di dimensione per ogni coppia di esperimenti. Il valore medio dei tre esperimenti è dato come MeanVal = 0.88. La trama a destra è il conteggio assoluto delle colonie rilevate in ogni esperimento., n Ctr = 48 e n Li = 40 mostrano il conteggio medio delle colonie per le immagini di controllo e di luce rispettivamente. I diversi colori utilizzati qui sono per mostrare diverse coppie (1:controllo/2: luce) di esperimenti.

AutoCellSeg disegna automaticamente informazioni a priori dagli esempi di input anche se le colonie hanno una variazione di dimensioni notevolmente elevata. Pertanto, AutoCellSeg può essere facilmente utilizzato per altri set di dati., Questo può funzionare anche per diverse strutture cellulari, anche quando non sono molto rotonde, poiché AutoCellSeg tiene conto dell’eccentricità degli oggetti usando l’input grafico di conoscenza a priori. AutoCellSeg estrae anche altre funzionalità a priori in base all’intensità, in caso di rilevamento di falsi positivi. Un esempio video di utilizzo di AutoCellSeg per l’analisi della coppia di controllo/test è fornito in Dati supplementari 4.

Applicazione ad altri set di dati

AutoCellSeg è stato applicato ad altri set di dati immagine con colonie., È ragionevole provare un set di dati di immagini ben segmentate con uno sfondo e un primo piano diversi per mostrare la robustezza di AutoCellSeg. Inoltre, è anche indispensabile dimostrare le prestazioni di AutoCellSeg in diverse modalità operative. Sono state inoltre mostrate le prestazioni di AutoCellSeg sulla segmentazione cellulare dei mammiferi fluorescenti e sui dati batch e su immagini selezionate casualmente (vedere Dati supplementari 5).,

Sfondo invertito

Una sfida sarebbe quella di utilizzare un set di dati con uno sfondo chiaro con colonie più scure in primo piano per vedere se il software può adattarsi bene alle colonie. Abbiamo utilizzato un set di dati fornito sul sito web del progetto OpenCFU: https://sourceforge.net/projects/opencfu/files/samples/plosPicHQ.zip/download, che si basa su stafilococco. Au. su piastre LB agar. Ci sono 19 immagini di alta qualità in questo set di dati ciascuno con una risoluzione di 1538 × 1536. AutoCellSeg è stato confrontato con OpenCFU eseguendo entrambi in modalità parzialmente automatizzata (vedere ‘Selezione del processo’ in Dati supplementari 2).,

La conoscenza a priori di OpenCFU si basa su trail e error e non è disponibile una panoramica del set di dati completo. OpenCFU è stato eseguito con il raggio minimo di 1 pixel (parametro globale) per le colonie poiché diverse immagini hanno colonie molto piccole. Le impostazioni dei parametri per AutoCellSeg sono riportate in Dati supplementari 5.

I risultati per uno dei piatti densamente popolati sono mostrati in Fig. 5. OpenCFU fa un buon lavoro nel trovare quasi tutte le colonie in modalità automatizzata., La sottostima delle colonie da parte di AutoCellSeg in questo caso è stata causata dall’esclusione delle colonie sui confini della capsula di Petri nella modalità completamente automatizzata senza correzione. Tuttavia, la verità di base non era a portata di mano disponibile dal link in cui è stato scaricato questo set di dati. Pertanto, era ragionevole confrontare i risultati di entrambi i software tra loro. Se scegliamo un valore molto piccolo per raggio inferiore in OpenCFU, il rumore all’esterno del contenitore viene rilevato come mostrato nella seconda immagine della seconda riga in Fig. 5., Qui, AutoCellSeg ha un vantaggio perché la maschera contenitore viene estratta automaticamente e non viene rilevato nulla al di fuori di esso. D’altra parte, AutoCellSeg può lasciare alcune colonie più piccole inosservate a seconda della selezione dell’utente durante la fase di estrazione a priori. Ma questo è raramente il caso e può essere facilmente risolto nella fase di correzione.

Risultati di segmentazione AutoCellSeg e OpenCFU per le immagini con sfondo più chiaro e colonie più scure., Le caselle blu (immagine in alto a sinistra) mostrano il risultato del rilevamento da OpenCFU e la delineazione verde (immagine in alto a destra) è per la segmentazione AutoCellSeg. Sezioni ingrandite delle aree immagine selezionate delle immagini in prima riga senza post-editing (seconda riga). Risultato dopo la fase di correzione (ultima riga). OpenCFU ha perso un conglomerato di colonie (prima immagine, seconda fila). OpenCFU ha rilevato un po ‘ di rumore al di fuori del piatto (seconda immagine, seconda riga). Segmentazione AutoCellSeg della stessa sezione della prima immagine della seconda riga (terza immagine, seconda riga)., In AutoCellSeg, alcune colonie sul bordo del piatto rimangono inosservate (ultima immagine, seconda fila). Segmento errato rilevato all’esterno potrebbe essere eliminato in OpenCFU (seconda immagine, ultima riga). I segmenti non rilevati possono essere cliccati in modo interattivo in AutoCellSeg (terza immagine, ultima riga). In base al punto seme definito dall’utente, la colonia non rilevata viene segmentata utilizzando il metodo di marcia veloce (ultima immagine, ultima riga).,

Nella post-elaborazione, solo la rimozione di falsi segmenti è possibile in OpenCFU come indicato dalla freccia nella seconda immagine dell’ultima riga in Fig. 5. Qui sta un problema lampante, che nel caso di segmenti non rilevati, un utente non può aggiungere nuovi segmenti (vedi prima immagine in seconda fila di Fig. 5). A questo proposito, AutoCellSeg offre la massima flessibilità aggiungendo segmenti non rilevati e rimuovendo quelli falsamente rilevati (vedi terza immagine in seconda e terza fila di Fig. 5)., L’obiettivo qui è quello di confrontare il conteggio delle colonie per tutte le immagini da entrambi i software tenendo conto delle dimensioni delle colonie rilevate. Il conteggio finale ottenuto da entrambi i software era abbastanza comparabile (vedi Dati supplementari 5).