DISCUSSIONE

Il presente studio ha dimostrato la possibilità di inattivare fotodinamicamente i batteri gram-positivi e gram-negativi dopo incubazione con acido 5-ALA o MAL. Il profilo caratteristico della produzione di porfirina indotta da 5-ALA in funzione della concentrazione del substrato sottolinea la forte relazione tra questi due parametri e l’importanza di determinare le concentrazioni efficaci ottimali di ciascun substrato., La curva a forma di campana osservata è in accordo con le curve ottenute in studi di coltura cellulare di porfirine indotte da derivati 5-ALA e 5-ALA (27).

È noto che, oltre a PPIX, le porfirine in generale possono inibire diversi enzimi coinvolti nel ciclo biosintetico dell’eme al fine di evitare l’accumulo di grandi quantità di PAP intracellulari (1). Tuttavia, questo feedback negativo comporterebbe la comparsa di un plateau in termini di produzione totale di porfirina con concentrazioni crescenti di 5-ALA e non può spiegare la curva a forma di campana., I nostri risultati hanno mostrato che a concentrazioni superiori alla concentrazione ottimale, 5-ALA stessa sembra avere un effetto inibitorio sulla formazione di porfirina, anche se le concentrazioni di farmaci tossici non sono state raggiunte. Inoltre, gli stessi batteri incubati con MAL hanno prodotto quantità significativamente maggiori di PAP rispetto al composto progenitore, suggerendo che non sono state raggiunte le massime capacità di produzione di PAP.

Le differenze nelle concentrazioni ottimali osservate per 5-ALA e MAL possono derivare da diversi meccanismi di assorbimento., È ben noto che nelle cellule animali, 5-ALA e MAL vengono trasportati nel citosol attraverso diversi meccanismi di trasporto attivo (23); tuttavia, più derivati lipofili entrano attraverso la diffusione passiva attraverso le membrane o l’endocitosi. Nei batteri gram-negativi, la doppia membrana impedisce la penetrazione di molecole esogene, mentre le porine, che sono canali transmembrana, consentono solo a piccole molecole idrofile, solitamente nutrienti, di entrare nei batteri (18)., Pertanto, l’ingresso di 5-ALA nei batteri gram-negativi non è problematico (28), come dimostrato dalla bassa concentrazione necessaria per un’induzione PAP ottimale. Nel caso di MAL, l’aggiunta di una catena metilica sul gruppo carbossilico aumenta il coefficiente di ripartizione olio-acqua da -1,52 a -0,94 (27), che è ancora considerato idrofilo. Quindi, questo composto può anche entrare nel citosol batterico attraverso i canali di porina., Tuttavia, le alte concentrazioni (da 3 a 10 mm) necessarie per indurre una sufficiente formazione di PAP indicano che la penetrazione o la disponibilità possono variare da quella del composto progenitore.

Il fatto che più derivati lipofili, come PAL, HAL e OAL, non inducano alcuna significativa formazione di PAP potrebbe essere spiegato dall’intrappolamento di questi composti altamente lipofili nelle membrane batteriche o dal fatto che le proprietà altamente anfifiliche di questi derivati possono indurre la rottura della membrana, causando tossicità scura.,

Abbiamo visto una forte correlazione tra l’efficienza PDI e la quantità totale di PAP formata in E. coli K-12. Tuttavia, questo non può essere estrapolato ad altri ceppi a causa dei diversi tipi di porfirine prodotte, dei meccanismi di protezione (12) e della localizzazione della porfirina. Tutti i tipi di porfirine osservati nel nostro studio hanno dimostrato la capacità di assorbire la luce e generare specie reattive dell’ossigeno (22). La principale differenza tra queste porfirine endogene è legata al numero di parti carbossiliche, che influenzano la solubilità, la lipofilia, l’aggregazione e la localizzazione., Nel caso di E. coli, si è visto che il tipo di PAP dipende dalla quantità di porfirine prodotte. Quando vengono sintetizzate piccole quantità di porfirine, il macchinario enzimatico dei batteri è stato in grado di procedere alla decarbossilazione di un’alta percentuale di queste porfirine, portando all’accumulo di porfirine principalmente lipofile. Quando vengono prodotte quantità molto grandi di PAP, il processo enzimatico può essere sopraffatto, portando ad una maggiore percentuale di porfirine idrofile. Questa tendenza è stata osservata solo nei ceppi di E. coli (dati non mostrati per le altre specie)., Al contrario, S. aureus ha prodotto quasi esclusivamente UPS ed è stato fotoinattivato in modo efficiente, mentre P. aeruginosa ha prodotto da quattro a cinque volte più porfirine, principalmente PPIX, ma non è stato fotoinattivato in modo più efficiente.

Per ottenere un’efficiente PDI mediata da derivati 5-ALA o 5 – ALA, le due condizioni principali necessarie sono l’accumulo di quantità sufficienti di PAP nei batteri mirati e l’irradiazione efficace per attivare il PS. Infatti, quando viene utilizzato questo tipo di profarmaco PS, la PDI condotta in condizioni non ottimali può portare a risultati contraddittori. Ad esempio, Karrer et al., (10) hanno dimostrato che la PDI mediata da 5-ALA ha indotto un’inibizione significativa della crescita di S. aureus ma non di Staphylococcus epidermidis. Al contrario, Nitzan et al. (19) ha osservato che la PDI mediata da 5-ALA era efficace sia contro S. aureus che contro S. epidermidis ma non contro i ceppi gram-negativi, inclusi E. coli e P. aeruginosa. Gli ultimi due ceppi sono stati fotoinattivati con successo da Szocs et al. (24) e Lee et al. (14), rispettivamente, dopo incubazione con 5-ALA., Pertanto, il presente studio dimostra chiaramente non solo che le concentrazioni devono essere ottimizzate e adattate ai batteri specifici, ma anche che la lipofilia del precursore PAP stesso deve essere ottimizzata. Mentre MAL e BAL sembravano essere più efficaci nell’inattivare E. coli, 5-ALA ha dimostrato di avere la capacità di inattivo in modo efficiente S. aureus ad alte concentrazioni., Nel presente studio ci siamo concentrati principalmente sui precursori PAP che hanno ottenuto l’approvazione di marketing per la somministrazione topica (5-ALA, MAL e HAL), due composti di lipofilia intermedia (BAL e PAL) e un altro composto lipofilo (OAL) che era ancora solubile in acqua alle concentrazioni utilizzate nel nostro studio. Tuttavia, in studi futuri dovrebbero essere considerati composti lipofili più moderatamente, come gli esteri etilico, propilico e benzilico.,

Nel nostro studio, sia 5-ALA che MAL hanno dimostrato di indurre una maggiore quantità di PAP in tutti i batteri trattati quando sono state applicate le condizioni ottimali. In E. coli, l’effetto inibitorio totale osservato dopo incubazione con MAL, sebbene sia stato osservato a concentrazioni di farmaco più elevate, è stato fino a 2 ordini di grandezza superiore a quello ottenuto dopo incubazione con 5-ALA. Tuttavia, questo vantaggio non è stato osservato negli altri ceppi utilizzati nel presente studio., Nella pratica clinica, MAL potrebbe avere altri vantaggi, soprattutto per quanto riguarda le sue proprietà farmacocinetiche e farmacodinamiche, che sono stati stabiliti in studi clinici per il trattamento dei carcinomi a cellule basali e cheratosi attinica (6, 7, 17). Poiché 5-ALA presentava una curva di inattivazione bifasica, le concentrazioni intermedie hanno determinato l’inattivazione subottimale dei batteri bersaglio. Un comportamento più desiderabile è stato ottenuto con MAL, poiché la sopravvivenza batterica diminuiva continuamente con l’aumentare delle concentrazioni di MAL., In questo caso, la formazione di PAP, e quindi, PDI, è stata inibita solo quando sono state raggiunte concentrazioni di farmaci tossici (superiori a 10 mm).

Non solo è importante la capacità di indurre PAPs, ma i derivati 5-ALA, incluso MAL, possono anche avere già stabilito vantaggi rispetto alla biodisponibilità locale dopo somministrazione topica per il trattamento di altre patologie. La somministrazione topica di MAL ha dimostrato di provocare una distribuzione più selettiva e più profonda di PAP in pazienti con carcinomi basocellulari spessi (20)., Pertanto, le infezioni più profonde possono essere trattate in modo più efficace con questo composto. In alcuni casi, MAL è stato dimostrato di essere più selettivo di 5-ALA per il tessuto malato, come cheratosi solari (6), potenzialmente portando a meno danni collaterali nel tessuto sano circostante. Inoltre, MAL ha dimostrato di avere un assorbimento sistemico limitato ed è stato riportato che induce meno dolore durante l’irradiazione, che è un parametro importante quando sono necessarie più sessioni di PDT (11).,

Le concentrazioni più efficaci utilizzate in questo studio possono sembrare relativamente elevate rispetto alle concentrazioni di altri composti PS, che vengono utilizzati a concentrazioni micromolari; infatti, per alcuni altri composti PS, il tempo di applicazione è di minuti invece di ore (25, 26). Tuttavia, l’elevata selettività dei composti che abbiamo testato, come dimostrato in altri domini medici, può fornire i mezzi per sradicare potenzialmente le infezioni batteriche senza danneggiare i tessuti circostanti sani.,

L’uso dei composti testati nei nostri studi sarà limitato alle infezioni batteriche che sono accessibili alla somministrazione locale sia del farmaco che della luce, compresa la pelle, i polmoni, la cavità orale, l’area urogenitale e il tratto gastrointestinale. Ad esempio, i primi studi clinici hanno dimostrato risultati promettenti dalla PDI mediata da 5-ALA di Helicobacter pylori (30). Gli attuali sviluppi in questo settore si concentrano sullo sviluppo di derivati sistemicamente applicabili di 5-ALA con emivita prolungata, che eluderanno la necessità di applicare i composti localmente., Inoltre, la ripetibilità può essere una risorsa importante della PDI, poiché la tossicità cumulativa (21) e la resistenza batterica indotta a trattamenti ripetuti (13) non sono state finora riportate.

Pertanto, quando sono state utilizzate concentrazioni ottimali, i derivati a catena corta 5-ALA e 5-ALA (MAL e BAL) hanno indotto alti livelli di accumulo di PAP sia nei ceppi batterici gram-positivi che gram-negativi che abbiamo testato, raggiungendo il primo prerequisito per una PDI di successo., Al contrario, i derivati 5-ALA a catena lunga (PAL, HAL e OAL) hanno dimostrato alte tossicità scure che aumentavano con la lipofilia e l’induzione con questi composti non ha mostrato alcuna significativa formazione di PAP. Poiché MAL ha indotto efficacemente la formazione di PAP nei batteri, potrebbe mostrare una migliore efficacia in vivo, soprattutto a causa delle sue vantaggiose proprietà farmacocinetiche e farmacodinamiche. La sua capacità di essere utilizzata per il trattamento delle infezioni locali deve essere ulteriormente studiata in esperimenti in vivo.