În acest capitol, rezultate din noile date de referință-am creat și alte seturi de date utilizate în lucrări anterioare sunt prezentate. AutoCellSeg a fost comparat cu alte instrumente software folosind diferite măsuri de calitate.,

Noi date de referință

Am marcat 12 de imagini, care au fost achiziționate de la laboratoarele noastre, pentru adevărul la sol de la diferite specii bacteriene (3 imagini fiecare), inclusiv E. coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa și Staphylococcus aureus. Imaginile au fost etichetate prin delimitarea limitelor coloniilor folosind Adobe Photoshop și apoi cu MATLAB pentru a crea imagini binare etichetate. În consecință, aceste imagini ale adevărului sunt folosite pentru a extrage: (1) Numărul coloniilor (2) dimensiunea fiecărei colonii individuale în pixeli.,rapoartele anterioare privind specificitatea și sensibilitatea instrumentelor utilizate pentru numărarea coloniilor se bazează în principal numai pe numărul total. O astfel de comparație oferă o perspectivă mai mică asupra plauzibilității coloniilor, în special în ceea ce privește dimensiunea detectată. Dimensiunea fiecărei colonii ar putea avea o importanță egală în multe experimente. Prin urmare, ar trebui încorporat și un criteriu de calitate bazat pe precizia segmentării. Măsura de calitate Q, bazată pe24, a fost utilizată pentru a evalua rezultatul procesului de segmentare (a se vedea datele suplimentare 1 Pentru mai multe detalii)., Q ia în considerare: diferența dintre numărul de segmente în ceea ce privește adevărul la sol (q1) și numărul de pixeli de segment clasificați greșit (q2).folosind Q pe noul benchmark, au fost comparate diferite instrumente (Vezi Fig. 2). Deoarece atât IJM cât și ImageJ Edge eșuează în prezența containerului CFU în imagine, am optat pentru soluții alternative precum OpenCFU. Ne-am dezvoltat, de asemenea, o comandă de conducte în CellProfiler, bazat pe activitatea desfășurată by8, și o combinație de Ilastik și CellProfiler pentru comparație cu AutoCellSeg., In timp ce AutoCellSeg extrage automat zona Petri dish, Cellprofiler și OpenCFU nu. În OpenCFU este necesară o regiune de interes (ROI) sub forma unui cerc în 3 puncte sau a unui poligon complex pentru a extrage informațiile prezente numai în interiorul containerului. Funcția „Auto-Petri” menționată în12 nu este nicăieri văzută pe GUI-ul său și nici nu funcționează perfect la back-end, deoarece în mai multe rezultate zgomotul din afara vasului a fost segmentat. O conductă separată a fost utilizată pentru fiecare specie și poate fi găsită în depozitul AutoCellSeg: https://github.com/AngeloTorelli/AutoCellSeg/tree/master/DATA/Benchmark., De exemplu, CellProfiler conducte și rezultatele pentru E. coli pot fi găsite în folderul propriu: https://github.com/AngeloTorelli/AutoCellSeg/tree/master/DATA/Benchmark/E. coli/CellProfiler. Datorită reglării Manuale a parametrilor și selectarea manuală a vasului perti, CellProfiler nu poate fi soluția pentru un randament ridicat și o segmentare complet automatizată. Rezultatul segmentării produs de cellprofiler este bun pentru seturile de date de referință, prin urmare a fost inclus pentru comparație.,

Rezultatele metodelor utilizate pe noul punct de reper: CellProfiler (roșu), Ilastik + CellProfiler (cyan), OpenCFU (albastru) și AutoCellSeg (verde). O imagine din fiecare specie este selectată (indicată de numărul imaginii din colțurile imaginii) pentru a demonstra comparația. Graficele arată Segmentarea / numărarea (Q pe axa y a primului rând) și abaterea de la numărarea manuală (q1 pe axa y a celui de-al doilea rând) pentru toate metodele utilizate pe baza benchmark-ului complet (pe axa x)., Q încorporează măsurile atât pentru dimensiunea și numărul de CFU.

includerea Ilastik fost făcut, pentru că oferă rezonabil pixelwise predicție cu ajutorul supravegheate de învățare mașină. Pentru fiecare specie bacteriană, a fost luată o singură imagine pentru etichetarea pixelilor din fundal și a coloniilor (două probleme de clasă) folosind toate caracteristicile disponibile până când segmentarea rezultată a fost aproape de adevărul de la sol. Rezultatele segmentării au fost exportate ca fișiere TIFF și apoi combinate cu conducta CellProfiler pentru cuantificare.,OpenCFU evită detectările false datorită criteriilor sale de selecție atentă a coloniilor. În OpenCFU utilizatorul trebuie să fie atent cu privire la intervalul de dimensiunea coloniei pentru a fi introduse manual folosind bara glisantă. Dacă este selectată o rază inferioară foarte mică, OpenCFU produce o mulțime de fals pozitive, pe lângă detectarea zgomotului atât în interiorul, cât și în exteriorul containerului CFU. În schimb, dacă o rază mai mică este setată la o valoare adecvată (adică 25-35 în cazul Staphylococcus aureus), numărul coloniilor este în mare măsură subestimat., Un utilizator trebuie mai întâi să încerce valori diferite pentru raza inferioară pentru a obține un rezultat bun de segmentare. Selectarea acestor valori poate fi banală pentru utilizatorul expert, dar chiar și atunci necesită încercări și erori dacă trebuie evaluate diferite seturi de date cu rezoluții diferite. Această problemă este corectată în mod adecvat în AutoCellSeg, unde utilizatorul trebuie doar să facă clic pe o colonie mică și mare, deoarece raza inferioară și superioară sunt apoi extrase automat folosind metoda rapidă de marș.

altă problemă principală în OpenCFU este că nu există nici o soluție de transfer complet automatizat lot., Un utilizator trebuie să facă clic manual pe fila”> ” din GUI pentru a procesa următoarea imagine. Acest lucru împiedică capacitatea sa de a fi utilizat pentru seturi de date mai mari chiar și atunci când parametrii globali pentru segmentare/numărare ar putea fi setați în siguranță. În schimb, AutoCellSeg permite să fie utilizate într-un mod complet automatizat, fără nici un fel de intervenție umană în timpul său proces care rulează.

Ambele OpenCFU și AutoCellSeg au fost operate în modul semi-automat (vezi Procesul de Selecție în Date Suplimentare 2 pentru diferite moduri de operare)., Rezultatele segmentării au fost obținute ca măști binare direct de la AutoCellSeg și conducta CellProfiler. Cu toate acestea, în cazul OpenCFU, caracteristicile utilizabile pentru compararea calității necesare sunt centrul și raza coloniilor. Acesta este un alt dezavantaj al OpenCFU, că nu se poate obține o mască binară direct pentru compararea numărului/mărimii coloniilor cu adevărul de la sol. Folosind centrul și raza coloniilor, am reconstruit cercurile binare pentru a emula coloniile și am folosit segmentarea bazinului hidrografic pentru a separa coloniile suprapuse., Acest lucru a fost făcut pentru a se potrivi cu numărul și dimensiunea coloniilor extrase din software-ul OpenCFU. Toate cele trei măști binare obținute au fost comparate cu adevărul de la sol pentru numărul total și dimensiunea coloniilor folosind Q.

câteva exemple de rezultate din noul set de date de imagine de referință sunt prezentate în Fig. 2. Roșu, cyan, albastru și verde, culorile sunt folosite pentru a reprezenta CellProfiler, Ilastik + CellProfiler, OpenCFU și AutoCellSeg respectiv. În unele cazuri, cellprofiler oferă o segmentare foarte bună., Rezultatele Ilastik cu CellProfiler în lot operațiunea nu a fost drastic mai bine decât OpenCFU sau CellProfiler. Cu toate acestea, combinația dintre cele două produce rezultate comparabile cu AutoCellSeg când etichetarea toate imaginile individual, dar vine la cheltuieli de timp și de etichetare efort. AutoCellSeg depășește în continuare celelalte soluții în ceea ce privește calitatea Q a rezultatului segmentării. Comparația individuală poate fi văzută în graficele din Fig. 2., General comparație între AutoCellSeg, OpenCFU și CellProfiler și combinația de Ilastik + Cellprofiler este dat în Tabelul 1 folosind o medie Q valoarea (Q m ) și medie t1 valoare (q1,m).

Control/ încercare de analiză

spre Deosebire de alte analize CFU soluții software, AutoCellSeg are posibilitatea de a compara diferite moduri de date., De exemplu, într-un experiment microbiologic, poate fi necesar să se cunoască modificările morfologiei CFU și numărul care apar în timpul tratamentului. Testul a fost acela de a iradia coloniile cu lumină albastră pentru a observa diferențele de mărime și număr de colonii. Prin urmare, AutoCellSeg solicită utilizatorului să selecteze imagini de control și de testare pentru a face o comparație experiment înțelept. De exemplu, am ales un set de imagini de control și testare de la E. coli. Se efectuează un test (adică iradierea luminii) pentru a observa modificarea dimensiunii CFU în ceea ce privește imaginile de control.,există trei perechi de test / control reprezentate de numere. Imaginile sunt încărcate în AutoCellSeg și parametrii sunt ajustați așa cum se arată în datele suplimentare 3. Programul este apoi rulat în modul semi-automat. Corecția se face la fiecare imagine în parte și atunci când toate imaginile sunt procesate, utilizatorul poate alege pentru a afișa parcele comparație. Contururile segmentului (ieșirea după rularea procesului) sunt rezultatele detectării AutoCellSeg. Rezultatele segmentării pentru toate imaginile sunt afișate în: https://github.com/AngeloTorelli/AutoCellSeg/tree/master/DATA/control_test., Contururile Cyan reprezintă delimitarea CFU de control, iar roșul reprezintă contururile din experimentul de testare în funcție de Convenția de denumire. Pentru fiecare pereche de seturi de date, o funcție Kernel Density Estimation (KDE) este reprezentată grafic reprezentând distribuția dimensiunii coloniilor (în pixeli) așa cum se arată în Fig. 3. Funcția returnează o estimare a densității de probabilitate a dimensiunii CFU. Estimarea se bazează pe o funcție normală a nucleului și este evaluată la puncte egale, x i, care acoperă intervalul de date din x. aici, x este utilizat pentru a descrie dimensiunea CFU a.,

Analiză de control/imagini de test: Primul și al doilea rând de pe stânga arată segmentarea rezultate pentru control (albastru deschis) și testare (roșu) imagini respectiv. În partea dreaptă, graficul Kernel Density Estimation (KDE) este afișat pe axa y pentru dimensiunile coloniilor în pixeli (axa x). Lățimea de bandă (bw = 2000) determină aici netezimea curbelor., Liniile verzi din complot reprezintă rezultatele experimentului de control, unde liniile roșii reprezintă rezultatele experimentului de testare (iradierea luminii în cazul nostru). Numărul de colonii găsite în fiecare imagine este notat cu n folosind culoarea roșie / verde pe baza tipului de experiment (lumină/control).

în graficul din Fig. 3, curba verde descrie distribuția mărimii în coloniile de control, iar curba roșie punctată arată distribuția mărimii CFU după iradierea luminii. Netezimea curbei este controlată de un parametru de lățime de bandă bw., În acest set de date, am folosit bw = 2000. Folosind valori mai mici bw ar putea duce la curbe mai puțin lin și, probabil, mai mult de un vârfuri în funcție de varianța în mărime de CFU. Valorile negative la începutul axei x se datorează extrapolării funcției de netezire pe partea stângă a vârfului în x-data. Acest lucru nu indică existența coloniilor cu o zonă CFU negativă.de asemenea, este posibil pentru a vedea schimbarea în zona și numărul de CFU după experimente de testare. În Fig. 4, graficul din stânga arată schimbarea zonelor CFU după iradierea luminii., Zonele de control sunt normalizate la 1. Fiecare culoare este folosită pentru a reprezenta un experiment diferit. În general, dimensiunile CFU sunt considerate a scădea după iradierea luminii în acest caz. Graficul din dreapta Fig. 4 arată numărul absolut CFU atât în condițiile de control, cât și în cele de testare. Se poate observa că numărul mediu din această sesiune de experiment a scăzut. În mod similar, diferite imagini din experimentele de control și testare pot fi analizate în AutoCellSeg.,

Prezentare generală parcele de schimbare în numărul și dimensiunea de Cfu după test de experimente. Graficul din stânga arată modificarea dimensiunilor coloniilor absolute (normalizate la 1 pentru fiecare pereche individuală de control/test). Acest lucru este demonstrat pentru a exprima modificarea dimensiunii pentru fiecare pereche de experimente. Valoarea medie a celor trei experimente este dată ca MeanVal = 0.88. Parcela din dreapta este numărul absolut de colonii detectate în fiecare experiment., n Ctr = 48 și n Li = 40 arată numărul mediu de colonii pentru imagini de control și, respectiv, lumină. Diferitele culori folosite aici sunt pentru a arăta diferite perechi (1:control/2: lumină) de experimente.

AutoCellSeg atrage o priori informații în mod automat de intrare exemple chiar dacă coloniile au un considerabil de mare variație în dimensiune. Prin urmare, AutoCellSeg poate fi utilizat cu ușurință pentru alte seturi de date., Acest lucru poate funcționa și pentru diferite structuri celulare, chiar și atunci când nu sunt foarte rotunde, deoarece AutoCellSeg ia în considerare excentricitatea obiectelor folosind introducerea grafică a priori a cunoștințelor. AutoCellSeg extrage, de asemenea, alte caracteristici a priori bazate pe intensitate, în cazul detectării falselor pozitive. Un exemplu video de utilizare a AutoCellSeg pentru analiza perechilor de control/test este dat în datele suplimentare 4.

aplicarea la alt set de date

AutoCellSeg a fost aplicat la alte seturi de date de imagine cu colonii., Este rezonabil să încercați un set de date de imagini bine segmentate cu un fundal și un prim-plan diferit pentru a arăta robustețea AutoCellSeg. Mai mult decât atât, este imperativ să se demonstreze performanța AutoCellSeg în diferite moduri de funcționare. De asemenea, a fost prezentată performanța AutoCellSeg asupra segmentării celulelor fluorescente de mamifere și a datelor lotului și asupra imaginilor selectate aleatoriu (A se vedea datele suplimentare 5).,

fundal inversat

o provocare ar fi să folosiți un set de date care are un fundal deschis cu colonii mai întunecate în prim-plan pentru a vedea dacă software-ul se poate adapta bine coloniilor. Am folosit un set de date furnizat pe site-ul proiectului OpenCFU: https://sourceforge.net/projects/opencfu/files/samples/plosPicHQ.zip/download, care se bazează pe stafilococ. au. pe plăci de agar LB. Există 19 imagini de înaltă calitate în acest set de date, fiecare cu o rezoluție de 1538 × 1536. AutoCellSeg a fost comparat cu OpenCFU prin rularea ambelor în modul parțial automatizat (a se vedea „selecția procesului” din datele suplimentare 2).,

cunoștințele a priori pentru OpenCFU se bazează pe traseu și eroare și nici o imagine de ansamblu a setului complet de date este disponibil. OpenCFU a fost rulat cu raza minimă de 1 pixel (parametru global) pentru colonii, deoarece mai multe imagini au colonii foarte mici. Setările parametrilor pentru AutoCellSeg sunt date în datele suplimentare 5.rezultatele pentru una dintre vasele dens populate sunt prezentate în Fig. 5. OpenCFU face o treabă bună în găsirea aproape toate coloniile în modul automat., Subestimarea coloniilor de către AutoCellSeg în acest caz a fost cauzată de excluderea coloniilor la limitele vasului petri în modul complet automatizat fără corecție. Cu toate acestea, adevărul de la sol nu a fost disponibil de la linkul în care a fost descărcat acest set de date. Prin urmare, a fost rezonabil să comparăm rezultatele ambelor programe între ele. Dacă alegem o valoare foarte mică pentru raza inferioară în OpenCFU, zgomotul din afara containerului este detectat așa cum se arată în a doua imagine din al doilea rând din Fig. 5., Aici, AutoCellSeg are un avantaj deoarece masca containerului este extrasă automat și nimic nu este detectat în afara acesteia. Pe de altă parte, AutoCellSeg poate lăsa unele colonii mai mici nedetectate în funcție de selecția utilizatorului în timpul fazei de extracție a priori. Dar acest lucru este rareori cazul și poate fi ușor rezolvat în etapa de corecție.

AutoCellSeg și OpenCFU segmentare rezultate pentru imagini cu fundal brichetă și mai inchisa colonii., Casetele albastre (imaginea din stânga sus) arată rezultatul detectării OpenCFU și delimitarea verde (imaginea din dreapta sus) este pentru segmentarea AutoCellSeg. Secțiuni mărite ale zonelor de imagine selectate ale imaginilor din primul rând fără post-editare (al doilea rând). Rezultat după etapa de corecție (ultimul rând). OpenCFU a ratat o conglomerare de colonii (prima imagine, al doilea rând). OpenCFU a detectat un zgomot în afara vasului (a doua imagine, al doilea rând). AutoCellSeg segmentarea aceeași secțiune ca și în prima imagine a doilea rând (a treia imagine, al doilea rând)., În AutoCellSeg, unele colonii de pe marginea vasului rămân nedetectate (ultima imagine, al doilea rând). Segmentul eronat detectat în exterior ar putea fi șters în OpenCFU (a doua imagine, ultimul rând). Segmente nedetectate ar putea fi făcut clic pe interactiv în AutoCellSeg (a treia imagine, ultimul rând). Pe baza punctului de semințe definit de utilizator, Colonia nedetectată este segmentată folosind metoda de marș rapid (ultima imagine, ultimul rând).,

În post-procesare, doar eliminarea false segmente sunt posibile în OpenCFU cum este indicat de săgeată în a doua imagine din ultimul rând, în Fig. 5. Aici se află o problemă evidentă, că, în cazul segmentelor nedetectate, un utilizator nu poate adăuga noi segmente (vezi prima imagine din al doilea rând din Fig. 5). În acest sens, AutoCellSeg oferă flexibilitate deplină prin adăugarea nedetectate și eliminarea segmentelor detectate în mod fals (a se vedea a treia imagine din al doilea și al treilea rând din Fig. 5)., Scopul aici este de a compara numărul de colonii pentru toate imaginile de către ambele programe, luând în considerare dimensiunea coloniilor detectate. Numărul final obținut din ambele programe a fost destul de comparabil (a se vedea datele suplimentare 5).