Los linfocitos T citotóxicos (CTL) son células efectoras específicas de antígenos del sistema inmunitario con la capacidad de lisar células diana, como células infectadas por virus, células aloinjertadas o incluso parásitos de manera dependiente del contacto. Al igual que otros linfocitos T, las CTL inicialmente se diferencian en el timo, donde adquieren el receptor específico de células T (TCR), un heterodímero de 90 kDa compuesto por una cadena α de 40-50 kDa y una cadena β de 37-45 kDa ., El TCR está estrechamente asociado con la glicoproteína CD3, un complejo de tres a cinco proteínas invariantes que son aparentemente responsables de la transducción de señales. La mayoría de CTL también lleva moléculas CD8, que se cree que se unen reversiblemente al receptor de la célula diana. Otras moléculas de superficie (CD2, CD28, molécula de adhesión intracelular) parecen desempeñar un papel importante en la activación de CTL después del reconocimiento de antígenos a través de TCR.
las CTL son incapaces de reconocer antígenos libres., Por lo tanto, los antígenos son absorbidos inicialmente por células específicas, como las células dendríticas y las células de Langerhans, que procesan y presentan el antígeno en su superficie junto con moléculas del complejo de histocompatibilidad mayor de clase I (MHC I). Por lo tanto, la Unión de antígenos de CTL siempre está restringida a los determinantes correctos de MHC. El reconocimiento y la Unión de antígenos son seguidos por la proliferación y diferenciación de CTL, un evento que es promovido por varias citocinas . La activación antígeno-específica de CTL se asocia con alteraciones morfológicas distintas., Las células aumentan de tamaño, se polarizan altamente y forman gránulos lisómicos únicos que contienen un patrón específico de proteínas líticas.
la lisis de las células objetivo a través de CTL procede a través de una secuencia de pasos programados, incluyendo la Unión de células asesinas-objetivo, la entrega del golpe letal, la lisis de células objetivo y el reciclaje de células asesinas. Después del reconocimiento del antígeno apropiado, la CTL se une firmemente a la superficie de la célula diana, un evento que depende de la presencia de Mg2+ pero no de Ca2+., La lisis subsiguiente de las células diana está mediada por dos mecanismos diferentes: exocitosis de proteínas líticas y/o unión receptor-ligando de moléculas Fas / APO. Las diversas vías pueden resultar en diferentes tipos de muerte celular Diana: necrosis y apoptosis. Aquí, los diferentes mecanismos de matanza de CTL se describen con más detalle.
los lisosomas de CTL tienen una morfología única que solo se puede ver por microscopía electrónica (13). Cada gránulo tiene un núcleo denso de electrones rodeado por pequeñas vesículas redondas., Dentro del núcleo, varios tipos de proteínas líticas se almacenan en una forma inactiva. Cuando las células objetivo efectoras se unen, los lisosomas se dirigen hacia el área de contacto mediante la reorientación del centro de organización de microtúbulos. Posteriormente, el contenido de los gránulos se libera en el espacio intercelular a través de la exocitosis. La citólisis de la célula diana es mediada por dos tipos de proteínas líticas, perforina y granzimas, que actúan solas o en combinación entre sí.
vía de perforación.
la vía de perforación se muestra en la Fig. 1., La perforina es una proteína formadora de poros de 70 kDa (6). Está codificado por un gen de copia única que se encuentra en el cromosoma 10 y contiene tres exones. Los genes de perforina de ratón y humanos muestran una homología significativa, y la transcripción del gen puede ser controlada en ambas especies por múltiples factores reguladores cis y/o transactivos similares. Además, existen homología de secuencia distinta y reactividad cruzada inmunológica entre los componentes de perforina y complemento; en particular, en la porción central de las moléculas (residuos de aminoácidos 189-218)., Otra región conservada ubicada entre los residuos 356 y 366 fue encontrada para el tipo precursor del factor de crecimiento epidérmico. Los experimentos con péptidos sintéticos y perforina recombinante revelaron que la porción NH2-terminal de perforina es el dominio más importante para la actividad lítica.
la FIGURA 1. Presentación Esquemática del mecanismo de muerte mediado por linfocitos T citotóxicos (CTL). La perforina (barras) y las granzimas (óvalos) se almacenan juntas dentro de los lisosomas de la CTL y se secretan a través de la exocitosis en la dirección de la célula diana., La perforina se inserta en la membrana celular Diana como monómero y posteriormente forma poros de membrana a través de la polimerización. Las granzimas entran en las células diana a través de los poros perforados o a través de la endocitosis. Fas / APO-L Se expresa dentro de la membrana CTL como una molécula homotrimérica y por lo tanto induce la agrupación en la unión al FAS/APO-receptor (R) de la célula diana. La vía Fas / APO se desencadena por el reclutamiento de proteínas citoplasmáticas (Fadd-mort TRADD, RIP) que se unen al dominio de muerte Fas/APO-R., Las Fas / APO y las granzimas parecen tener una vía común para la inducción de la apoptosis de las células diana mediante la activación de proteasas similares a la enzima de conversión de interleucina-1 (ICE). MHC, complejo mayor de histocompatibilidad.
después de la síntesis en el retículo endoplásmico rugoso, las moléculas de perforina son presumiblemente modificadas postranslacionalmente por N-glicolización y se almacenan en la matriz densa del núcleo de los lisosomas CTL como monómeros. Los monómeros de perforina liberados se insertan en la membrana de las células diana., Aunque todavía no se han encontrado los receptores postulados para la perforina, hay alguna evidencia de que las mitades de fosforilcolina sirven como moléculas de unión (12). En el siguiente paso, los monómeros de perforina Unidos a la membrana polimerizan y forman poros con un diámetro promedio de 16 nm (10). Los poros se asemejan a los del complejo de ataque de membrana del complemento; estos últimos, sin embargo, son más pequeños en diámetro (~10 nm) y están hechos por varios componentes del complemento (C5b, C6, C7, C8 y C9)., La muerte de la célula diana a través de perforina está mediada por la afluencia incontrolada de pequeñas moléculas como Ca2+ del fluido extracelular o por inducción de estrés osmótico, lo que resulta en lisis osmótica coloide. Además, los poros perforados pueden servir como conducto para otras proteínas que matan CTL, como las granzimas (8).
La morfología de la muerte mediada por perforina se caracteriza por necrosis de las células diana (Figs. 2a y 3). Desestabilización de la membrana, que puede ser identificada por cualquier microscopía de luz con pruebas de exclusión de colorante (Fig. 2A) o Microscopía Electrónica de transmisión (Fig., 3), es la indicación inicial de la muerte de la célula de la blanco. La inflamación de los orgánulos y la interrupción del citoesqueleto son las siguientes etapas de la muerte necrótica, pero el núcleo permanece intacto durante un tiempo prolongado. Finalmente, la célula diana se disuelve completamente, formando restos celulares con orgánulos residuales y fragmentos de membrana.
la FIGURA 2. Aspecto microscópico ligero de la interacción entre CTL (asteriscos) y células de melanoma., Las muestras fueron etiquetadas con sulfo-NHS-biotina (rojo), que entra en las células solo después del daño de la membrana, y posteriormente teñidas con el método de etiquetado de ADN de 3′-end (Verde, tinción de Tunel), que permite la detección de la fragmentación del ADN. Luego se examinaron las células con un microscopio láser confocal. Fila superior: imagen de contraste de interfaz diferencial; fila inferior: imagen de fluorescencia correspondiente. A y a’: el citoplasma de la célula del melanoma muestra un marcado intenso con sulfo-NHS-biotina, lo que indica daño en la membrana, pero no se detecta tinción de Tunel; esta morfología es característica de la necrosis., B y B’: El núcleo de la célula del melanoma se tiñe claramente por el método de Tunel, pero el citoplasma no está marcado con sulfo-NHS-biotina, que es característico de la apoptosis temprana. c y C’: el citoplasma de la célula del melanoma se tiñe difusamente con sulfo-NHS-biotina, y los fragmentos nucleares se etiquetan intensamente con el método de Tunel, una apariencia morfológica típica de la apoptosis tardía. Aumento: ×700 (a y b) y ×800 (C).
la FIGURA 3. Necrosis de la célula diana mediada por CTL., CTL (asterisco) está en estrecho contacto con la célula del melanoma, que muestra una clara alteración de la membrana celular y la hinchazón de los orgánulos, mientras que el núcleo parece estar intacto. Aumento = ×5,800.
estudios recientes con ratones con deficiencia de perforina (knockout) confirmaron el importante papel de la perforina en la citólisis mediada por células tanto in vitro como in vivo (4,7). La CTL y las células asesinas naturales de ratones con deficiencia de perforina no son capaces de lisar las células diana alogénicas y las células tumorales., Además, estos animales no pueden eliminar las infecciones de virus de la coriomeningitis linfocítica y son incapaces de rechazar la asig – y xenotransplantes de las células tumorales. Estos resultados muestran inequívocamente que el mecanismo de la perforina también está activo en condiciones in vivo. Sin embargo, las CTL deficientes en perforina no son completamente inactivas, pero muestran una capacidad lítica residual que puede estar mediada por otras vías.
Granzymes.
Las Granzimas son un grupo de serinas esterasas con actividad similar a la tripsina y la asparaginasa, respectivamente (8)., Hay al menos tres tipos de granzimas (A, B y H) en la LCT humana con una masa molecular que varía entre 27 y 60 kDa. Son altamente glicosilados y antigenéticamente relacionados, como lo demuestra su alto grado de reactividad cruzada. Los diversos tipos de granzimas se almacenan dentro de la matriz granular de los lisosomas de CTL, junto con la perforina, y se secretan a través de exocitosis en la dirección de la célula diana en la muerte mediada por CTL. Dentro de las células diana, las granzimas inducen la fragmentación del ADN a nivel internucleosomal, lo que resulta en la muerte celular apoptótica (3).,
Las alteraciones morfológicas iniciales de la apoptosis mediada por CTL ocurren dentro del núcleo (Figs. 2b y 4a), que se caracteriza por la condensación de heterocromatina en depósitos puntuales o semilunas a lo largo de la envoltura nuclear, mientras que los orgánulos celulares aparecen sin cambios. Además, múltiples manchas de membrana son detectables en la superficie celular, que pueden ser liberadas en el espacio intercelular (Fig. 4b)., Los pasos posteriores de la muerte celular apoptótica se definen morfológicamente por la fragmentación del núcleo en pequeños cuerpos redondos u ovalados seguidos por la destrucción completa de la célula diana (Fig. 2c).
la FIGURA 4. Ultraestructura de la apoptosis mediada por CTL. R: El CTL (asterisco) sobresale profundamente en el citoplasma de la célula del melanoma. Obsérvese la condensación de heterocromatina y la fragmentación del núcleo celular Diana. Aumento = ×5,800., b: por microscopía electrónica de barrido, múltiples blebs son detectables en la superficie de la célula del melanoma, mientras que CTL (asteriscos) muestran solo volantes cortos de membrana. Aumento = ×4,200.
en contraste con la forma clásica de apoptosis, que, por ejemplo, ocurre como muerte celular programada durante la diferenciación prenatal, la fragmentación del ADN mediada por CTL progresa rápidamente, es decir, en minutos, y es independiente de la síntesis de nuevas proteínas en las células diana. La vía para la matanza mediada por granzyme no se conoce completamente., Las granzimas por sí mismas no son efectivas en la destrucción de las células diana, como se muestra en los experimentos de transfección y en los estudios que utilizan granzimas purificadas a o B. Por lo tanto, se sugiere que las granzimas entran en la célula diana a través de los poros de la perforina y solo entonces son capaces de actuar intracelularmente. Dentro de las células diana, pueden promover la degradación del ADN mediante la escisión de histonas, lo que resulta en un acceso más fácil de las desoxirribonucleasas al núcleo., Sin embargo, cada vez más evidencia indica que las granzimas también están indirectamente involucradas en la degradación del ADN, ya sea por la unión a proteínas nucleares como la nucleolina, que posteriormente escinde el ADN, o la activación de la vía de la enzima de conversión de IL-1 (ICE) hacia arriba o hacia abajo (11). Si este último es el caso, entonces las granzimas dispararían una vía apoptótica intracelular similar como se postula para la muerte por CTL mediada por ligando del receptor.,
citólisis mediada por receptor-ligando (vía Fas/APO)
las CTL activadas llevan un ligando específico Fas/APO (Fas/APO-L), también llamado ligando CD95, que se expresa tras el reconocimiento del antígeno ya sea por síntesis de novo o por transformación de una forma inactiva a una forma activa (1). Fas / APO-L es una molécula transmembrana de 40 kDa tipo II. Pertenece a la superfamilia del factor de necrosis tumoral (TNF), que también incluye TNF-α, linfotoxina (LT)-α, LT-β, OX40-L, CD40-L, CD27-L y CD30-L., Estas moléculas existen como proteínas ligadas a la membrana trimérica y se caracterizan por una homología parcial de la región del aminoácido COOH-terminal dentro del espacio extracelular. El receptor FAS/APO correspondiente (FAS / APO-R, CD95-R) es una glicoproteína transmembrana de 48 kDa. Se expresa en una variedad de células y se regula al alza en células que proliferan rápidamente, por ejemplo, linfocitos y células tumorales. El Fas / APO-R tiene un dominio citoplasmático de 65 aminoácidos que se sugiere que es responsable de la generación de la señal de muerte celular Diana y, por lo tanto, se llama el «dominio de muerte.,»El dominio de muerte de Fas / APO-R es altamente homólogo al del receptor TNF-α y, aparentemente, existe una superposición funcional entre ambos receptores. Debido a que los dominios de muerte no tienen función catalítica, se sugiere que las proteínas citoplasmáticas se reclutan después de la Unión del ligando del receptor y se utilizan como mensajeros aguas abajo para la muerte. De hecho, se han encontrado recientemente varias proteínas asociadas al dominio de muerte (TRADD, FADD / MORT-1 y RIP) que podrían ser responsables de la transducción de señales (2).,
la interacción del receptor del ligando Fas / APO resulta en una apoptosis típica de la célula diana, que es morfológicamente indistinguible de la muerte celular mediada por granzima. La vía intracelular para la inducción de la apoptosis mediada por Fas no es completamente conocida. Sin embargo, hay cada vez más evidencia de que las proteasas citoplasmáticas están involucradas en la regulación y ejecución de la apoptosis (9), ya que se ha encontrado que varias proteínas, incluyendo la poli(ADP-ribosa)polimerasa, lamina B1, α-fodrina, β-actina y topoisomerasa I, se degradan con el inicio de la apoptosis., En particular, las enzimas similares al hielo (una familia de proteinasas de cisteína, ahora llamadas caspasas), que se han detectado originalmente en el nematodo Caenorrhabditis elegans, podrían ser un componente central de la maquinaria de muerte celular, como se muestra en los experimentos de expresión e inhibición. Por lo tanto, la vía Fas/APO podría resultar en una cascada de proteasa amplificada que luego desencadena la fragmentación del ADN dentro del núcleo.,
estudios recientes en ratones con mutación natural en Fas / APO-L (cepa gld) y Fas/APO-R (cepa lpr) revelaron un trastorno linfoproliferativo policlonal asociado con agrandamiento de órganos linfáticos periféricos (ganglios linfáticos, bazo) y una enfermedad similar al lupus en los animales. Por lo tanto, la falta de una vía funcional Fas/APO resulta en la proliferación incontrolada de células T debido a un fallo en la eliminación por apoptosis., Por lo tanto, se sugiere que en condiciones fisiológicas la vía Fas/APO regula la homeostasis de las poblaciones celulares normales y es particularmente necesaria para el control del crecimiento y la diferenciación de los linfocitos.
conclusión
la citotoxicidad mediada por CTL se caracteriza por varios mecanismos líticos que se dirigen contra diferentes estructuras de la célula diana (la membrana celular y el núcleo). La combinación de perforina y granzimas aumenta significativamente la capacidad lítica de CTL., Las células diana pueden reparar los poros perforados por endocitosis de fragmentos de membrana, pero al mismo tiempo incorporan granzimas que inducen la fragmentación del ADN. El tipo de muerte celular, necrosis o apoptosis, aparentemente está determinado por la propia célula diana y parece depender del ciclo celular y el metabolismo de la célula diana. La vía Fas/APO ofrece una capacidad lítica adicional de CTL que se utiliza para el control de la proliferación de células T. Cada vez hay más pruebas de la existencia de otros mecanismos líticos mediados por miembros de la familia del TNF (TNF-α y linfotoxina-α/β) (5)., Estos mecanismos, sin embargo, muestran una cinética lítica más lenta y pueden ser efectivos solo cuando los procesos de matanza dominantes son ineficaces.